[4] Comparación de la proteína verde fluorescente mejorada y su forma desestabilizada como reporteros de transcripción

Este capítulo describe la utilidad de la proteína verde fluorescente (GFP) como gen reportero en el estudio de la expresión génica. La GFP emite luz fluorescente en la excitación, sin la adición de sustrato o cofactor, tanto in vivo como in vitro. La actividad fluorescente de la GFP puede detectarse mediante un microscopio de fluorescencia, un fluorómetro, una máquina de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o un lector de microplacas de imágenes. La GFP mejorada (EGFP) es un mutante de la GFP con una fluorescencia más brillante que hace que la detección sea mucho más sensible. El uso de la GFP como gen informador ofrece una serie de ventajas. Entre ellas, el análisis en tiempo real, la manipulación mínima de la muestra, la posibilidad de realizar análisis de grandes cantidades y la alta sensibilidad. Sin embargo, la GFP es una proteína estable, por lo que se acumula fácilmente cuando se expresa en las células. La acumulación hace que la expresión inducible del reportero sea insensible a cualquier cambio en la inducción y, por tanto, sería difícil de utilizar en estudios cinéticos. En este capítulo se analiza la utilidad de la EGFP y la EGFP desestabilizada (dEGFP) como reporteros de transcripción, fusionándolas con la secuencia de unión a NF-KB y el promotor de la timiclina quinasa (TK), y comparando la diferencia de expresión entre la EGFP y la dEGFP. Se discute que tanto la EGFP como la dEGFP pueden utilizarse como reporteros en estudios de transcripción. Además, la dEGFP es más sensible en respuesta a los cambios en el tratamiento del factor de necrosis tumoral (TNF) debido a su mayor velocidad de recambio.

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