Transporte de cistina y cistinosina
La cistina se acumula dentro de los lisosomas de los leucocitos cistinóticos14 y los fibroblastos.44 La cloroquina y otros inhibidores de la degradación de proteínas lisosomales atenúan la reacumulación de cistina en las células cistinóticas agotadas, lo que indica que la degradación de proteínas intracelulares es la fuente del exceso de cistina45. El contenido de cistina de las células normales y cistinóticas también puede aumentarse cargando con dimetiléster de cistina46 o disulfuro mixto de cisteína-glutatión44; sin embargo, la salida de cistina de los lisosomas se ve notablemente afectada en las células cistinóticas cargadas de cistina.44,46 La salida de cistina de las células derivadas de los portadores heterocigotos del gen de la cistinosis nefropática no está significativamente alterada en comparación con las células de tipo natural.44 Sin embargo, la medición del contratransporte de cistina-cistina en los gránulos lisosómicos demuestra claramente su ausencia en los pacientes homocigotos, con valores para los portadores heterocigotos que son aproximadamente la mitad de los de las células normales de control47; el transporte defectuoso de cistina lisosómica es, por tanto, el defecto causante de la cistinosis.
El diagnóstico bioquímico tanto de los pacientes48 como de los portadores heterocigotos49 fue fundamental para el mapeo preciso del gen de la cistinosis en el cromosoma 17p13. Un avance clave fue la detección de deleciones genómicas para un marcador de microsatélite vinculado, seguido de la identificación del gen CTNS dentro del intervalo mínimo de deleción.50 El gen CTNS consta de 12 exones, que codifican una proteína de 367 aminoácidos llamada cistinosina. La cistinosina consta de siete dominios transmembrana, un extremo N de 128 aminoácidos que contiene siete sitios de glicosilación y un extremo C citosólico de 10 aminoácidos. Todos los pacientes con los distintos subtipos de cistinosis parecen tener una mutación en el gen CTNS (es decir, hasta ahora no hay pruebas de heterogeneidad genética). La mutación más común es una deleción de 57 kb que desplaza la región 5′ aguas arriba del exón 1051,52; más del 70% de los pacientes con cistinosis nefropática de ascendencia europea del norte son homocigotos para esta mutación.52-Bendavid y sus colegas han desarrollado sondas de hibridación fluorescente in situ para esta gran deleción, la primera de este tipo para un trastorno de almacenamiento lisosómico.55 Se han identificado mutaciones de efecto fundador putativo separadas en el Canadá francés56 (W138X, de origen irlandés) y en la provincia francesa de Bretaña57 (una mutación de sitio de empalme al final del exón 8). Se ha identificado una mutación de sentido erróneo recurrente (G339R) en dos poblaciones étnicas concretas: dos familias no relacionadas de ascendencia amish-menonita y cinco familias no relacionadas de origen judío-marroquí.58-61 También se han identificado otras 50 mutaciones de CTNS, incluyendo al menos tres pacientes con mutaciones en la región promotora del gen.62 Los pacientes con cistinosis juvenil u ocular son homocigotos para una mutación «más leve», normalmente una mutación puntual sin alteración del marco de lectura abierto; alternativamente, estos pacientes son heterocigotos compuestos para una mutación leve y otra más grave.17,59
La cistinosina se expresa ampliamente, con una transcripción particularmente abundante en el páncreas, el músculo y el riñón.50 La inmunohistoquímica con anticuerpos contra la cistinosina63 y la transfección de células con ADN complementario marcado con epítopos (ADNc)64,65 revelan que la proteína se expresa en los lisosomas. Como era de esperar, la expresión de la cistinosina es particularmente robusta en el túbulo proximal renal.63 La localización de la cistinosina en la membrana lisosomal depende tanto de un motivo de clasificación lisosomal basado en la tirosina GYDQL situado en la cola C-terminal como de un pentapéptido YFPQA dentro del quinto bucle intertransmembrana. El motivo YFPQA es algo único en el sentido de que es un ejemplo raro de una señal de clasificación lisosómica situada fuera de la cola citoplasmática.64 Parece mostrar cierta capacidad para rescatar la clasificación de la cistinosina por sí misma, dado que la cistinosina mutante con un motivo GYDQL ausente pero con un motivo YFPQA intacto sigue localizándose parcialmente en los lisosomas.65 Una minoría de mutaciones de la cistinosis afectan a la localización lisosómica de la cistinosina, debido a la alteración primaria del motivo GYDQL o a efectos aún no caracterizados sobre la estructura secundaria.66
La caracterización funcional de la cistinosina explotó la redirección de la proteína a la membrana plasmática en un mutante, cistinosina-.GYDQL, que carece del motivo GYDQL C-terminal.67 La cistinosina-.GYDQL funciona así como un transportador de cistina impulsado por H+ en la membrana plasmática de las células transfectadas. Es altamente específico para la L-cistina; otros aminoácidos, en particular el monosulfuro de cisteína, no son sustratos. La cistinosina es saturable y sigue la cinética de Michaelis-Menton, con una Km para la cistina de ∼280 μM.67 El transporte hacia el interior es estimulado considerablemente por un pH extracelular ácido-fuera (Fig. 14-6); el colapso de este gradiente transmembrana de H+ por la adición de nigericina suprime el transporte, lo que es consistente con el cotransporte de H+-cistina por la cistinosina. El transporte lisosómico de cistina depende a su vez de la presencia de adenosina trifosfato (ATP), que alimenta la H+-ATPasa lisosómica e impulsa el eflujo de cistina (Fig. 14-7).46,68,69
El constructo cistinosina-.GYDQL se ha utilizado para la caracterización funcional de mutaciones de sentido erróneo asociadas a enfermedades en cistinosina. En su mayor parte, el transporte y los fenotipos clínicos se correlacionan, con la abolición del transporte por las mutaciones asociadas a la cistinosis nefropática y la función residual mediada por los constructos que expresan las mutaciones asociadas a los subtipos juvenil y ocular de la enfermedad.66 Sin embargo, algunas mutaciones asociadas a la cistinosis juvenil suprimen el transporte en el contexto de la cistinosina-.GYDQL, lo que sugiere que estas mutaciones tienen efectos menores en la cistinosina de longitud completa expresada en las membranas lisosomales; una posibilidad es que la cistinosina interactúe con las proteínas lisosomales que estabilizan estas formas mutantes particulares.66 También ocurre lo contrario, de modo que algunas mutaciones de cistinosis nefropática tienen un efecto mínimo sobre el transporte mediado por cistinosina-.GYDQL.66
La supresión dirigida de cistinosina en ratones conduce a la acumulación de cistina en múltiples órganos, incluido el riñón.70 Puede detectarse el depósito focal de cristales de cistina en varios tejidos, incluso dentro de las células del túbulo proximal. Sin embargo, estos ratones no muestran una tubulopatía proximal, lo que sugiere que la acumulación de cristales de cistina por sí sola no es causante de la enfermedad.70 Sin embargo, las anomalías oculares en los ratones deficientes en cistinosina son muy similares a las de los pacientes con cistinosis. Así, estos animales desarrollan depósitos de cristales de cistina en la córnea y manchas despigmentadas en la retina, indicativas de una retinopatía.70