Cystine Transport and Cystinosin
Cystyna gromadzi się w lizosomach cystynotycznych leukocytów14 i fibroblastów.44 Chlorochina i inne inhibitory degradacji białek lizosomalnych zmniejszają ponowną akumulację cystyny w komórkach pozbawionych cystyny, co wskazuje, że źródłem nadmiaru cystyny jest wewnątrzkomórkowa degradacja białek.45 Zawartość cystyny w normalnych i cystynotycznych komórkach może być również zwiększona przez obciążenie dimetylowym estrem cystyny46 lub mieszanym disiarczkiem cysteiny i glutationu44; w szczególności, jednakże, wydalanie cystyny z lizosomów jest znacznie upośledzone w komórkach cystynotycznych obciążonych cystyną.44,46 Odpływ cystyny z komórek pochodzących od heterozygotycznych nosicieli genu cystynozy nefropatycznej nie jest znacząco upośledzony w porównaniu z komórkami typu dzikiego.44 Jednakże pomiar przeciwtransportu cystyny-cystyny w granulkach lizosomalnych wyraźnie wykazuje jego brak u homozygotycznych pacjentów, z wartościami dla heterozygotycznych nosicieli, które są w przybliżeniu o połowę niższe niż w normalnych komórkach kontrolnych47; wadliwy lizosomalny transport cystyny jest zatem defektem przyczynowym w cystynozie.
Biochemiczna diagnostyka zarówno pacjentów48, jak i heterozygotycznych nosicieli49 była krytyczna dla dokładnego mapowania genu cystynozy na chromosomie 17p13. Kluczowym przełomem było wykrycie delecji genomowych dla połączonego markera mikrosatelitarnego, a następnie identyfikacja genu CTNS w minimalnym przedziale delecji.50 Gen CTNS składa się z 12 eksonów, kodujących 367-aminokwasowe białko zwane cystynoiną. Cystynina składa się z siedmiu domen transmembranowych, 128-aminokwasowego N-końca, który zawiera siedem miejsc glikozylacji, oraz 10-aminokwasowego cytozolowego C-końca. Wszyscy pacjenci z różnymi podtypami cystynozy wydają się mieć mutację w genie CTNS (tzn. nie ma jak dotąd dowodów na heterogenność genetyczną). Najczęstszą mutacją jest delecja 57-kb, która przesuwa region 5′ w górę eksonu 1051,52; ponad 70% pacjentów z cystynozą nefropatyczną pochodzących z Europy Północnej jest homozygotycznych dla tej mutacji.52-54 Bendavid i współpracownicy opracowali sondy do hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ dla tej dużej delecji, pierwszej tego rodzaju dla lizosomalnych zaburzeń spichrzeniowych.55 Odrębne mutacje będące efektem założyciela zostały zidentyfikowane we francuskiej Kanadzie56 (W138X, pochodzenia irlandzkiego) i w prowincji Bretania we Francji57 (mutacja splice-site na końcu eksonu 8). Jedną powtarzającą się mutację typu missense (G339R) zidentyfikowano w dwóch szczególnych populacjach etnicznych: dwóch niespokrewnionych rodzinach pochodzenia amiszowo-mennonickiego i pięciu niespokrewnionych rodzinach pochodzenia żydowsko-marokańskiego.58-61 Zidentyfikowano również dodatkowe 50 mutacji CTNS, w tym co najmniej trzech pacjentów z mutacjami w regionie promotorowym genu.62 Pacjenci z cystynozą młodzieńczą lub oczną są homozygotami dla „łagodniejszej” mutacji, zwykle mutacji punktowej bez zaburzeń w otwartej ramce odczytu; alternatywnie, pacjenci ci są heterozygotami złożonymi dla łagodnej mutacji i cięższej mutacji.17,59
Cystynina ulega szerokiej ekspresji, ze szczególnie obfitym transkryptem w trzustce, mięśniach i nerkach.50 Immunohistochemia z przeciwciałami przeciwko cystynozynie63 oraz transfekcja komórek znakowanym epitopem komplementarnym DNA (cDNA)64,65 ujawnia, że białko to ulega ekspresji w lizosomach. Zgodnie z oczekiwaniami, ekspresja cystynozyny jest szczególnie silna w kanaliku proksymalnym nerki.63 Lokalizacja cystynozyny w błonie lizosomalnej zależy zarówno od tyrozynowego motywu sortowania lizosomalnego GYDQL zlokalizowanego na C-końcowym ogonie, jak i od pentapeptydu YFPQA w obrębie piątej pętli międzybłonowej. Motyw YFPQA jest w pewnym sensie wyjątkowy, ponieważ jest rzadkim przykładem sygnału sortowania lizosomalnego zlokalizowanego poza ogonem cytoplazmatycznym.64 Wydaje się, że wykazuje on pewną zdolność do samodzielnego ratowania sortowania cystynozyny, biorąc pod uwagę, że mutant cystynozyny z nieobecnym motywem GYDQL, ale nienaruszonym motywem YFPQA nadal częściowo lokalizuje się w lizosomach.65 Mniejszość mutacji w cystynozie wpływa na lizosomalne ukierunkowanie cystynoiny, z powodu pierwotnego zaburzenia motywu GYDQL lub jeszcze nie scharakteryzowanego wpływu na strukturę drugorzędową.66
Funkcjonalna charakterystyka cystynozyny wykorzystała przekierowanie białka do błony plazmatycznej w mutancie, cystynoina-.GYDQL, w którym brakuje C-końcowego motywu GYDQL.67 Cystynoina-.GYDQL działa zatem jako napędzany przez H+ transporter cystyny w błonie plazmatycznej transfekowanych komórek. Jest wysoce specyficzna dla L-cystyny; inne aminokwasy, w szczególności monosulfidy cysteiny, nie są substratami. Cystynozyna jest nasycalna i podlega kinetyce Michaelisa-Mentona, z Km dla cystyny wynoszącym ∼280 μM.67 Transport do wewnątrz jest znacznie stymulowany przez kwaśne zewnętrzne pH (ryc. 14-6); załamanie tego transmembranowego gradientu H+ przez dodanie nigerycyny znosi transport, co jest zgodne z kotransportem H+-cystyny przez cystynoinę. Lizosomalny transport cystyny jest z kolei zależny od obecności adenozynotrójfosforanu (ATP), który napędza lizosomalną H+-ATPazę i napędza odpływ cystyny (ryc. 14-7).46,68,69
Konstrukcja cystynosyna-.GYDQL została wykorzystana do funkcjonalnej charakterystyki związanych z chorobą mutacji mutacji typu missense w cystynosynie. W większości przypadków fenotypy transportu i kliniczne korelują ze sobą, ze zniesieniem transportu przez mutacje związane z cystynozą nefropatyczną i resztkową funkcją mediowaną przez konstrukty wyrażające mutacje związane z młodzieńczymi i ocznymi podtypami choroby.66 Jednakże niektóre mutacje związane z cystynozą młodzieńczą znoszą transport w kontekście cystynoiny-.GYDQL, co sugeruje, że mutacje te mają mniejszy wpływ na pełnowymiarową cystynoinę wyrażoną w błonach lizosomalnych; jedną z możliwości jest to, że cystynoina oddziałuje z białkami lizosomalnymi, które stabilizują te szczególne zmutowane formy.66 Odwrotnie, niektóre mutacje cystynozy nefropatycznej mają minimalny wpływ na transport mediowany przez cystynozynę-.GYDQL.66
Celowa delecja cystynozyny u myszy prowadzi do akumulacji cystyny w wielu narządach, w tym w nerce.70 Ogniskowe odkładanie się kryształów cystyny można wykryć w kilku tkankach, w tym w komórkach kanalików proksymalnych. Myszy te nie wykazują jednak tubulopatii proksymalnej, co sugeruje, że samo odkładanie się kryształów cystyny nie jest przyczyną choroby.70 Jednakże anomalie oczne u myszy z niedoborem cystyny są bardzo podobne do tych występujących u pacjentów z cystynozą. Zwierzęta te rozwijają złogi kryształów cystyny w rogówce i depigmentowane plamy w siatkówce, wskazujące na retinopatię.70
.