Tvorba komplexu D
Tvorba protrombinázy definuje důležitou modulační událost z katalytického hlediska, protože kompletní komplex je 300 000krát účinnější než volný faktor Xa působící na protrombin v roztoku.24,72 Důsledkem tohoto významného zvýšení rychlosti je, že jakákoli disociace složek komplexu významně a drasticky snižuje aktivitu enzymu. Absence membránového povrchu kompletního katalyzátoru má za následek tisícinásobnou ztrátu katalytické účinnosti, zatímco odstranění faktoru Va z komplexu vede k desetitisícinásobnému snížení rychlosti tvorby trombinu.24 Membránový povrch je nezbytně nutný, protože ačkoli přispívá jen málo k vlastní rychlosti katalýzy, poskytuje prostředí, v němž se může komplex faktoru Va a faktoru Xa i substrát kokokoncentrovat.277 Zdá se, že protrombin se koncentruje na povrchu membrány destičky z velké části prostřednictvím mechanismů zprostředkovaných receptory, které byly podrobně popsány dříve. Faktor Va díky své schopnosti vázat se na membránu vytváří obligátní a vysoce afinitní interakci s faktorem Xa, protože faktor Xa se v nepřítomnosti faktoru Va na aktivované destičky neváže. Koncentrace reaktantů na povrchu membrány vede k vysokým lokálním koncentracím činidel, které překračují vlastní Km reakce a výrazně zlepšují katalytickou účinnost. Kromě toho faktor Va zvyšuje rychlost obratu reakce mechanismem, který dosud nebyl racionalizován.278
Tvorba komplexu také poskytuje složkám protrombinasy ochranu před inhibitory a/nebo inaktivátory. Na rozdíl od faktoru Xa volného v roztoku je faktor Xa inkorporovaný do protrombinasy (tj. komplexovaný s membránově vázaným faktorem Va) chráněn před inhibicí antitrombinem III a heparinem.72 Stejně tak je faktor Va inkorporovaný do protrombinasy chráněn před proteolytickou inaktivací aktivovaným proteinem C109,110 – proces, který je podrobně popsán v následující části.73
Vnitřní Xasa je modulována řadou mechanismů podobných těm, které jsou pozorovány u protrombinasy. Tvorba komplexů vede k přibližně 2 × 107násobnému zvýšení katalytické účinnosti.217 Vazba faktorů VIIIa a IXaβ na destičky aktivované trombinem snižuje Km pro aktivaci faktoru X 2500krát a umožňuje faktoru VIIIa zvýšit kcat přibližně 7500krát. Antitrombin III nemůže inhibovat faktor IXaβ v přítomnosti faktoru VIIIa a krevních destiček.279 Podobně jako u faktoru Va moduluje tvorba komplexu faktoru VIIIa s faktorem IXaβ jeho aktivitu. Disociaci podjednotky A2 z heterotrimeru faktoru VIIIa, která vede k úplné ztrátě kofaktorové aktivity, brání jeho asociace s faktorem IXaβ na povrchu membrány,280 stejně jako jeho inaktivace APC.62,281
Protože je faktor Va absolutně nutný pro fyziologicky relevantní tvorbu trombinu, mohou být významné změny v aktivaci protrombinu realizovány prostřednictvím proteolytických, inaktivačních změn v kofaktoru katalyzovaných aktivovaným proteinem C. Proteolýza a inaktivace vyžadují, aby byl faktor Va vázán na destičky59,74 nebo na membránu.282 Dřívější studie ukázaly, že inkubace aktivovaného proteinu C s destičkami aktivovanými trombinem vedla k paralelnímu poklesu vazby faktoru Xa a aktivace protrombinu, což naznačuje, že po štěpení aktivovaným proteinem C faktor Va neváže faktor Xa.283,284 Inaktivace faktoru Va katalyzovaná aktivovaným proteinem C má tedy dramatický vliv na tvorbu trombinu.
Lidské krevní destičky jsou schopny podporovat a modulovat inaktivaci faktoru Va katalyzovanou aktivovaným proteinem C, ačkoli tyto dva kofaktorové pooly nejsou s ohledem na inaktivaci rovnocennými substráty. K účinné inaktivaci katalyzované aktivovaným proteinem C jsou zapotřebí tři štěpení těžkého řetězce molekuly lidského faktoru Va: Štěpení na Arg506, následované štěpením na Arg306 a Arg679,282,285 Štěpení na Arg506 je rychlejší a předchází membránově závislému, inaktivujícímu štěpení na Arg306,282 Trombinem aktivovaný povrch lidských krevních destiček hraje důležitou roli v inaktivované inaktivaci faktoru Va a varianty faktoru Va, faktoru VaLeiden, katalyzované aktivovaným proteinem C.109,110 Faktor VaLeiden vzniká trombinovou aktivací faktoru VLeiden, varianty, v níž byl Arg506 nahrazen glutaminem, čímž bylo v podstatě odstraněno štěpné místo aktivovaného proteinu C na pozici 506.286 Jedinci homozygotní (a v některých případech heterozygotní) pro tuto mutaci tak trpí slabou antikoagulační odpovědí na aktivovaný protein C a mají zvýšené riziko žilní trombózy.287-289 Normální a mutantní destičkové kofaktory jsou aktivovaným proteinem C inaktivovány téměř stejnou rychlostí; úplné inaktivace obou destičkových kofaktorů však není nikdy dosaženo,109,110 protože zůstává až 50 % původní aktivity. Tyto výsledky jsou ve výrazném kontrastu s tím, co bylo pozorováno při studiích inaktivace faktoru Va a faktoru VaLeiden odvozených z plazmy katalyzovaných aktivovaným proteinem C na syntetických fosfolipidových vezikulách.290-292 V těchto studiích byla vždy pozorována úplná inaktivace kofaktorů, ačkoli plazmatický faktor VaLeiden je inaktivován podstatně pomaleji než normální plazmatický faktor Va. Ve studiích na destičkách zůstává větší zbytková aktivita faktoru Va i faktoru VaLeiden, pokud se jako inaktivační membránový povrch použijí trombinem aktivované destičky, na rozdíl od téměř úplné inaktivace, pokud se jako inaktivační povrch použijí syntetické fosfolipidové vezikuly.110 Aktivované destičky tedy chrání destičkové kofaktory před inaktivací katalyzovanou aktivovaným proteinem C.109,110
Aktivované destičky také chrání normální plazmatický faktor Va před inaktivací aktivovaným proteinem C tím, že zpomalují štěpení na Arg506.110 Na rozdíl od destičkového kofaktoru však může být plazmatický faktor Va aktivovaným proteinem C zcela inaktivován, což naznačuje, že dva různé pooly kofaktorů (plazmatický vs. destičkový) jsou odlišnými substráty pro APC.110 Tyto studie opět potvrzují význam vazebných událostí při modulaci aktivity protrombinázy. Ukazují také, že destičkové a syntetické fosfolipidové membrány nejsou rovnocennými povrchy při regulaci tvorby enzymového komplexu. Souhrnně tyto studie naznačují, že krevní destičky udržují prokoagulační děje tím, že poskytují membránový povrch, který zpožďuje inaktivaci kofaktoru, a tím, že uvolňují molekulu kofaktoru, která vykazuje fenotyp rezistentní vůči aktivovanému proteinu C.
Zajímavá je úvaha, že v místech arteriálního poškození nemusí mutace faktoru VLeiden tak snadno předpovídat arteriální trombózu, protože normální a variantní kofaktory odvozené z krevních destiček jsou stejně rezistentní vůči aktivovanému proteinu C na aktivovaném povrchu krevní destičky. Ve skutečnosti prokázaná role mutace faktoru VLeiden v predikci žilní trombózy287-289 může odrážet dokumentovanou rezistenci plazmatického kofaktoru VaLeiden ve srovnání s normálním, plazmatickým faktorem Va.290-292 Plazmatický kofaktorový pool může hrát významnější roli při žilní trombóze, protože chybí významný příspěvek destiček. Naproti tomu v místě arteriálního trombu může být kofaktor pocházející z destiček v důsledku jeho uvolnění a aktivace přítomen v koncentraci více než 600krát vyšší než plazmatický kofaktor.106