Protein související s receptorem pro lipoprotein o nízké hustotě (LRP), člen rodiny genů pro receptor pro lipoprotein o nízké hustotě, zprostředkovává buněčné vychytávání rozmanitých ligandů. Skládací chaperon, 39-kDa protein asociovaný s receptorem (RAP), který se nachází v časných kompartmentech sekreční dráhy, inhibuje vazbu všech ligandů na receptor a může sloužit k prevenci předčasné vazby ligandů na receptor během transportu na povrch buňky. Abychom objasnili molekulární interakce, které jsou základem vzájemného působení mezi receptorem, RAP a ligandy, analyzovali jsme a vymezili vazebná místa inhibitoru aktivátoru plazminogenu-1 (PAI-1), komplexy aktivátoru plazminogenu tkáňového typu (t-PA).PAI-1, RAP a anti-LRP Fab fragmentu Fab A8. Za tímto účelem jsme vytvořili sérii rozpustných rekombinantních fragmentů zahrnujících druhý klastr repetic komplementového typu (C3-C10) a amino-terminální lemující repetice epidermálního růstového faktoru (E4) LRP (E4-C10; aminokyseliny 787-1165). Všechny fragmenty byly exprimovány stabilně transfekovanými buňkami ledvin křečka malého a purifikovány afinitní chromatografií. Podrobné studium vazby ligandu na fragmenty pomocí povrchové plazmonové rezonance odhalilo přítomnost tří odlišných, na Ca2+ závislých vazebných míst pro ligand v doméně klastru II (Cl-II) LRP. komplexy t-PA.PAI-1 i PAI-1 se vážou na doménu umístěnou v aminoterminální části Cl-II, která zahrnuje repetice E4-C3-C7. S tímto místem sousedí a částečně se překrývá vysoce afinitní vazebné místo RAP nacházející se na repeticích C5-C7. Fab A8, pseudoligand receptoru, se váže na třetí vazebné místo závislé na Ca2+ na repeticích C8-C10 na karboxylovém konci Cl-II. Dále jsme studovali inhibici vazby ligandu na LRP a na Cl-II zprostředkovanou RAP. Podle očekávání jsme pozorovali silnou inhibici vazby komplexu t-PA.PAI-1 a Fab A8 na LRP pomocí RAP (IC50 shodná s 0,3 nM), zatímco v opačném experimentu byla prokázána kompetice t-PA. PAI-1 komplexu a Fab A8 pro vazbu RAP na LRP bylo možné prokázat pouze při vysokých koncentracích konkurentů (>/=1 mikroM). Zajímavé je, že i když jsou rovnovážné disociační konstanty pro vazbu RAP na LRP a na Cl-II podobné, vazbě ligandů na Cl-II brání RAP pouze při koncentracích, které jsou nejméně o 2 řády vyšší než koncentrace potřebné pro inhibici vazby ligandu na LRP. Naše výsledky podporují modely, které navrhují alosterickou inhibici vazby ligandu na LRP vyvolanou RAP, která může vyžadovat části LRP, které se nacházejí mimo Cl-II receptoru.