Od zásadních objevů základních principů, na nichž je založeno molekulární klonování, byla vyvinuta řada klonovacích strategií s cílem zlepšit snadnost a rychlost rekombinace fragmentů DNA. Přečtěte si o nejběžnějších strategiích používaných při molekulárním klonování nebo získejte požadovaný gen v požadovaném vektoru snadným způsobem s klony GenEZ™ ORF. Začněte s hledáním svého genu.
Tradiční klonování
Tradiční klonování, nazývané také klonování PCR, vyžaduje použití polymerázové řetězové reakce (PCR) k amplifikaci templátové sekvence (obvykle zájmového genu) a přidání restrikčních míst na konce sekvence. Restrikční enzymy se používají k rozřezání zájmového templátu i cílového vektoru a ligáza DNA se používá ke spojení lepivých konců templátu a vektoru. Tradiční klonování umožňuje flexibilní manipulaci se sekvencí DNA, což usnadňuje sestavení téměř jakéhokoli požadovaného konstruktu. Kontrolní body a optimalizační postupy vyžadované při tradičním klonování však mohou být těžkopádné a potřebná činidla mohou být drahá.
TA klonování
TA klonování je jednou z nejjednodušších forem klonování. Při této metodě se používají vektory obsahující 5′ thyminové převisy, které přijímají produkty PCR, u nichž byly přidány další 3′ adenosinové převisy na základě povahy amplifikace polymerázy TAQ. Výhodou TA klonování je snadnost a rychlost, protože není nutný žádný krok restrikčního štěpení. Navíc soupravy pro TA klonování obsahují reakční pufry, které obsahují předem smíchaný vektor, ligázu a pufr, což zkracuje dobu ligační reakce na pouhých 5 minut. Nevýhodou technologie klonování TA je, že klonování není směrové, což znamená, že gen zájmu může být vložen do cílového vektoru buď ve smysluplné, nebo protismyslné orientaci. Obvykle polovina následných transformantů bude obsahovat gen ve směru sense a polovina ve směru antisense. Buňky transformované toxickými geny však mohou všechny vykazovat geny v antisense směru, protože buňky obsahující geny v sense směru nepřežijí. Kromě toho mohou být přeživší buňky obsahující toxické geny orientované ve směru smyslu mutovány tak, aby kódovaly méně toxický protein.
Bezšvové klonování
Technologie bezešvého klonování odstraňují požadavek na restrikční enzymy. To může být výhodné v případě, že insert obsahuje ve své sekvenci řadu restrikčních míst, takže je diffiskní identifikovat restrikční enzymy, které během klonovacího postupu nepřeruší gen zájmu. Bezešvé klonování využívá homologní rekombinace a existuje mnoho variant této techniky. Obecně postup spočívá v přidání flankingových sekvencí o délce přibližně 15 bp do inzertu i vektoru pomocí PCR. Exonukleázy se použijí k přežvýkání sekvencí inzertu a vektoru a DNA se spojí pomocí enzymů rekombinázy nebo DNA ligázy. Bezproblémové klonování bylo zjednodušeno vývojem sad, které již obsahují cílový vektor a patentovanou směs enzymů potřebných pro rekombinační reakci. Například sada GenBuilder™ společnosti GenScript dokáže klonovat inzerty o velikosti až 10 kb za 30 minut a lze ji použít i pro vysoce výkonné klonovací projekty.
.