[4] Sammenligning af forstærket grønt fluorescerende protein og dets destabiliserede form som transkriptionsreportere

Dette kapitel beskriver nytten af grønt fluorescerende protein (GFP) som et reportergen i studier af genekspression. GFP udsender fluorescerende lys ved excitation, uden tilsætning af substrat eller cofaktor, både in vivo og in vitro. GFP-fluorescensaktiviteten kan påvises ved hjælp af et fluorescensmikroskop, et fluorometer, en FACS-maskine (fluorescensaktiveret cellesortering) eller en mikropladelæser med billeddannelse. Enhanced GFP (EGFP) er en GFP-mutant med lysere fluorescens, som gør detektionen meget mere følsom. Anvendelse af GFP som reportergen giver en række fordele. Disse omfatter realtidsanalyse, minimal prøvehåndtering, mulighed for analyse af store mængder og høj følsomhed. GFP er imidlertid et stabilt protein, så det ophobes let, når det udtrykkes i celler. Akkumuleringen gør den inducerbare ekspression af reporteren ufølsom over for enhver ændring i induktionen, og det ville derfor være vanskeligt at anvende den i kinetiske undersøgelser. I dette kapitel diskuteres anvendeligheden af EGFP og destabiliseret EGFP (dEGFP) som transkriptionsreportere ved at fusionere dem med NF-KB-bindende sekvens og thymicline kinase (TK)-promotor og ved at sammenligne forskellen i ekspression mellem EGFP og dEGFP. Det diskuteres, at både EGFP og dEGFP kan anvendes som rapportører i transkriptionsundersøgelser. Desuden er dEGFP mere følsom som reaktion på ændringer i behandlingen med tumornekrosefaktor (TNF) på grund af dens hurtigere omsætningshastighed.

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.