Middlesex, county i det nordøstlige Massachusetts, USA, vest og nordvest for Boston og grænsende mod nord til New Hampshire. Amtet består af et højlandsområde, der afvandes af Merrimack-, Nashua-, Assabet-, Concord-, Sudbury- og Shawsheen-floderne. Andre vandløb omfatter Whitehall og Cambridge reservoirer, Lake Cochituate og den historiske Walden Pond. Parklandskabet omfatter mere end 20 statslige og føderale områder, især Townsend og Willard Brook statsskove, Hopkinton og Cochituate statsparker og Minute Man National Historical Park.
Middlesex blev oprettet i maj 1643 som et af Massachusetts’ tre oprindelige amter og blev opkaldt efter Middlesex i England. Amtssædet er Cambridge, hjemsted for Harvard University (grundlagt 1636) og Massachusetts Institute of Technology (1861). Andre højere uddannelsesinstitutioner omfatter Boston College (1863) i Chestnut Hill-Newton, Tufts University (1852) i Medford samt Bentley College (1917) og Brandeis University (1948) i Waltham. Lowell, mod nord, er landets første planlagte industrisamfund (indlemmet som by i 1826). Lexington og Concord, der er forbundet af Battle Road, var de første slagmarker i den amerikanske uafhængighedskrig. Flere bemærkelsesværdige forfattere fra det 19. århundrede boede i amtet: Henry Wadsworth Longfellow, Nathaniel Hawthorne, Ralph Waldo Emerson, Henry David Thoreau og Louisa May Alcott.
Byer som Somerville, Everett, Woburn, Malden, Marlborough og Melrose er med til at placere Middlesex blandt de 20 mest befolkede counties i USA. Det er også et af landets førende amter inden for fremstillingsindustrien. De vigtigste økonomiske aktiviteter er tekstilfremstilling, landbrug og højteknologiske virksomheder, især inden for luft- og rumfart og forsvar. Areal 2 133 kvadratkilometer (824 kvadratmiles). Indbyggertal. (2000) 1,465,396; (2010) 1,503,085.