Siden de grundlæggende opdagelser af de grundlæggende principper, der ligger til grund for molekylær kloning, er der blevet udviklet en række kloningsstrategier for at forbedre den lethed og hastighed, hvormed DNA-fragmenter kan rekombineres. Læs om de mest almindelige strategier, der anvendes ved molekylær kloning, eller få dit ønskede gen i den ønskede vektor på den nemme måde med GenEZ™ ORF-kloner. Start med at søge efter dit gen.
Traditionel kloning
Traditionel kloning, også kaldet PCR-kloning, kræver brug af polymerasekædereaktionen (PCR) til at amplificere den ønskede skabelonsekvens (normalt det ønskede gen) og tilføje restriktionssteder til enderne af sekvensen. Restriktionsenzymer anvendes til at skære både den interessante skabelon og målvektoren, og DNA-ligase anvendes til at forbinde de klæbrige ender af skabelonen og vektoren sammen. Traditionel kloning giver mulighed for fleksibel manipulation af DNA-sekvenser, hvilket gør det lettere at opbygge næsten alle ønskede konstruktioner. De kontrolpunkter og optimeringsprocedurer, der er nødvendige for traditionel kloning, kan dog være besværlige, og de nødvendige reagenser kan være dyre.
TA-kloning
TA-kloning er en af de enkleste former for kloning. Ved denne metode anvendes vektorer, der indeholder 5′ thyminoverhæng, til at acceptere PCR-produkter, hvor der er blevet tilføjet yderligere 3′ adenosinoverhæng ved TAQ-polymeraseamplifikationens natur. TA-kloning har den fordel, at den er let og hurtig, da der ikke kræves nogen restriktionsfordøjelsesfase. Desuden indeholder TA-kloningskits reaktionsbuffere, der indeholder den færdigblandede vektor, ligase og buffer, hvilket reducerer ligationsreaktionstiden til så lidt som 5 minutter. Ulempen ved TA-kloningsteknologien er, at kloningen ikke er retningsbestemt, hvilket betyder, at genet af interesse kan indsættes i målvektoren i enten sense- eller antisense-orientering. Normalt vil halvdelen af de efterfølgende transformanter indeholde genet i sense-retningen og halvdelen vil indeholde genet i antisense-retningen. Celler, der er transformeret med toksiske gener, kan dog alle vise generne i antisense-retningen, da celler, der indeholder de sense-orienterede gener, ikke vil overleve. Desuden kan overlevende celler, der indeholder giftige gener orienteret i sense-retningen, muteres til at kode for et mindre giftigt protein.
Sømløs kloning
Sømløse kloningsteknologier eliminerer kravet om restriktionsenzymer. Dette kan være en fordel, når et insert indeholder en række restriktionssteder i sin sekvens, hvilket gør det diffiekst at identificere restriktionsenzymer, der ikke skærer det pågældende gen under kloningsproceduren. Sømløs kloning udnytter homologe rekombination, og der findes mange variationer af denne teknik. Generelt består proceduren i at tilføje flanking-sekvenser med en længde på ca. 15 bp til både insertet og vektoren via PCR. Eksonukleaser anvendes til at tygge insert- og vektorsekvenserne tilbage, og DNA’et forbindes ved hjælp af rekombinaseenzymer eller DNA-ligase. Sømløs kloning er blevet forenklet ved udvikling af kits, der allerede indeholder målvektoren og en proprietær blanding af enzymer, der er nødvendige for rekombinationsreaktionen. GenScripts GenBuilder™ Kit kan f.eks. klone inserts på op til 10 kb på 30 minutter og kan også bruges til kloningsprojekter med højt gennemløb.
