Desde los descubrimientos seminales de los principios básicos que subyacen a la clonación molecular, se han desarrollado varias estrategias de clonación para mejorar la facilidad y la velocidad con la que se pueden recombinar los fragmentos de ADN. Lea sobre las estrategias más comunes utilizadas en la clonación molecular o consiga su gen deseado en el vector que desee de forma sencilla con los clones ORF de GenEZ™. Comience con una búsqueda de su gen.
Clonación tradicional
La clonación tradicional, también llamada clonación por PCR, requiere el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar la secuencia molde de interés (normalmente el gen de interés) y añadir sitios de restricción a los extremos de la secuencia. Las enzimas de restricción se utilizan para cortar tanto la plantilla de interés como el vector objetivo, y la ADN ligasa se utiliza para unir los extremos pegajosos de la plantilla y el vector. La clonación tradicional permite una manipulación flexible de la secuencia de ADN, lo que facilita la creación de casi cualquier construcción deseada. Sin embargo, los puntos de control y los procedimientos de optimización necesarios para la clonación tradicional pueden ser engorrosos, y los reactivos necesarios pueden ser caros.
Clonación AT
La clonación AT es una de las formas más simples de clonación. En este método, se utilizan vectores que contienen salientes de timina 5′ para aceptar productos de PCR en los que se han añadido salientes de adenosina 3′ adicionales por la naturaleza de la amplificación de la polimerasa TAQ. La clonación TA tiene la ventaja de la facilidad y la rapidez, ya que no se requiere ningún paso de digestión de restricción. Además, los kits de clonación TA contienen tampones de reacción que contienen el vector premezclado, la ligasa y el tampón, lo que reduce el tiempo de la reacción de ligación a tan solo 5 minutos. La desventaja de la tecnología de clonación TA es que la clonación no es direccional, lo que significa que el gen de interés puede insertarse en el vector diana tanto en sentido como en antisentido. Normalmente, la mitad de los transformantes subsiguientes contendrán el gen en la dirección del sentido y la otra mitad contendrá el gen en la dirección del antisentido. Sin embargo, las células transformadas con genes tóxicos pueden mostrar todos los genes en la dirección antisentido, ya que las células que contienen los genes dirigidos al sentido no sobrevivirán. Además, las células supervivientes que contengan genes tóxicos orientados en la dirección del sentido pueden mutar para codificar una proteína menos tóxica.
Clonación sin costuras
Las tecnologías de clonación sin costuras eliminan el requisito de las enzimas de restricción. Esto puede ser ventajoso cuando un inserto contiene una serie de sitios de restricción dentro de su secuencia, lo que hace difícil identificar las enzimas de restricción que no cortarán el gen de interés durante el procedimiento de clonación. La clonación sin fisuras aprovecha la recombinación homóloga y existen numerosas variaciones de la técnica. En general, el procedimiento consiste en añadir secuencias de flanking de aproximadamente 15 pb de longitud tanto al inserto como al vector mediante PCR. Se utilizan exonucleasas para masticar las secuencias del inserto y del vector y el ADN se une utilizando enzimas recombinasas o ADN ligasa. La clonación sin fisuras se ha simplificado con el desarrollo de kits que ya contienen el vector objetivo y una mezcla propia de enzimas necesarias para la reacción de recombinación. Por ejemplo, el kit GenBuilder™ de GenScript puede clonar insertos de hasta 10 kb en 30 minutos, y también puede utilizarse para proyectos de clonación de alto rendimiento.
