Materiaalit:
30ml eksponentiaalista SF9-soluviljelmää 5×105 solua/ml
6-kuoppalevyjä (2 kappaletta kutakin)
1pullo 4 %:n agaroosigeeliä
1pullo SF-900 (1.3X) medium
1steriili pullo
0.5ml bakuloviruksen supernatantti
100ml SFM
1. Annostellaan steriileissä olosuhteissa 2 ml solususpensiota kuoppaa kohti.
2. Annetaan solujen laskeutua levyn pohjalle ja inkuboidaan peitettynä RT:ssä 1h.
3. Asetetaan agaroosigeelipullo 70oC:n vesihauteeseen. Aseta tyhjä pullo ja SF-900 (1.3X) 40oC:n lämpöhauteeseen.
4. Kun levyjä on inkuboitu 1h RT:ssä, tarkkaile monokerroksia käänteismikroskoopilla solujen kiinnittymisen ja 50 %:n konfluenssin varmistamiseksi.
5. Valmistetaan kahdeksan login sarjalaimennos kerätystä viruksen supernatantista laimentamalla peräkkäin 0,5 ml edellistä laimennosta 4,5 ml:aan SFM-mediumia 12 ml:n kertakäyttöastioissa. Lopulta pitäisi olla 8 putkea, joissa kussakin on 10-1-10-8 laimennos alkuperäisestä viruskannasta.
7. Poistetaan supernatantti peräkkäin jokaisesta kuopasta, hävitetään ja korvataan välittömästi 1 ml:lla vastaavaa viruslaimennosta kuhunkin kaksoiskuoppaan. Inkuboidaan 1h RT:ssä.
8. Siirretään pullot vesialtaista steriiliin huppuun, kun agaroosi on nesteytynyt (20-30 min).Annostellaan tyhjään pulloon nopeasti 30 ml SF-900 (1.3X) -mediumia ja 10 ml 4 %:n agaroosigeeliä ja sekoitetaan varovasti. Palauta plakkien peittopullo 40oC:n vesihauteeseen käyttöön asti.
9. Tämän toisen 1 tunnin inkubaation jälkeen palauta laimennettua agaroosia sisältävä pullo ja 6-kuoppalevyt huppuun.
10. Poista virus kuopista peräkkäin (korkeasta laimennoksesta matalaan laimennokseen) ja vaihda tilalle 2 ml laimennettua agaroosia. Työskentele nopeasti, jotta vältät monokerroksen kuivumisen.Tyhjiöpumppuun kytketty Pasteur-pipetti poistaa helposti inokulumin jäljet.
11.Anna geelin kovettua 10-20 minuuttia ennen siirtämistä.
12.Inkuboi 27oC:ssa kostutetussa inkubaattorissa 4-10 päivää.
13.Rekombinantti-virus tuottaa maitomaisia/harmaita plakkeja, joilla on vähäinen kontrasti ja jotka näkyvät ilman värjäystä tai muita havaitsemismenetelmiä.
14.Seuraa plakkeja päivittäin, kunnes laskettujen plakkien määrä ei muutu kahtena peräkkäisenä päivänä.
15.Käytetyn inokulumin titterin määrittämiseksi optimaalinen laskentaväli on 3-20 plakkia kuoppaa kohti kuutiota 6 kuoppalevyllä. Titeri (pfu/ml) voidaan laskea seuraavalla kaavalla:
16. Agaroosin peittäminen Natural Red -väriaineella:
Valmistetaan 0,5-prosenttinen agaroosiliuos SFM:ään
Lisätään Natural Red -liuosta 50 mg/ml:n loppupitoisuuteen (laimennetaan 3,33 mg/ml:n varastoliuosta 1:66,6).
Värjäytetään 1 ml väriaineliuosta kumpaankin kuoppaan (kuuden kuopan levyllä).
Kerrotaan 1 ml väriaineliuosta kuhunkin kuoppaan.