La proteina correlata al recettore delle lipoproteine a bassa densità (LRP), un membro della famiglia del gene del recettore delle lipoproteine a bassa densità, media l’assorbimento cellulare di una diversità di ligandi. Un chaperone di ripiegamento, la proteina associata al recettore (RAP) da 39 kDa, che risiede nei primi compartimenti della via secretoria, inibisce il legame di tutti i ligandi al recettore e può servire a prevenire il legame prematuro dei ligandi al recettore durante il traffico verso la superficie cellulare. Per chiarire le interazioni molecolari che sono alla base dell’interazione tra il recettore, RAP e i ligandi, abbiamo analizzato e delineato i siti di legame dell’inibitore dell’attivatore del plasminogeno-1 (PAI-1), dell’attivatore del plasminogeno di tipo tissutale (t-PA).PAI-1 complessi, RAP e il frammento Fab anti-LRP Fab A8. A tal fine, abbiamo generato una serie di frammenti solubili ricombinanti che abbracciano il secondo cluster di ripetizioni di tipo complementare (C3-C10) e la ripetizione amino-terminale del fattore di crescita epidermico (E4) di LRP (E4-C10; aminoacidi 787-1165). Tutti i frammenti sono stati espressi da cellule di rene di criceto bambino trasfettate in modo stabile e purificati mediante cromatografia di affinità. Uno studio dettagliato del legame del ligando ai frammenti utilizzando la risonanza plasmonica di superficie ha rivelato la presenza di tre distinti, Ca2 +-dipendenti siti di legame del ligando nel dominio cluster II (Cl-II) di LRP. t-PA.PAI-1 complessi così come PAI-1 si legano a un dominio situato nella porzione amino-terminale di Cl-II, che abbraccia ripetizioni E4-C3-C7. Adiacente a questo sito e parzialmente sovrapposto è un sito ad alta affinità di legame RAP situato sulle ripetizioni C5-C7. Fab A8, uno pseudo-ligando del recettore, si lega ad un terzo sito di legame Ca2+-dipendente sulle ripetizioni C8-C10 all’estremità carbossil-terminale di Cl-II. Successivamente, abbiamo studiato l’inibizione mediata da RAP del legame del ligando a LRP e a Cl-II. Come previsto, abbiamo osservato una forte inibizione di t-PA.PAI-1 complesso e Fab A8 legame a LRP da RAP (IC50 congruente con 0,3 nM), mentre nell’esperimento inverso, la concorrenza di t-PA. PAI-1 complessi e Fab A8 per il legame RAP a LRP potrebbe essere mostrato solo ad alte concentrazioni di concorrenti (>/=1 microM). È interessante notare che, anche se le costanti di dissociazione di equilibrio per il legame di RAP a LRP e a Cl-II sono simili, il legame dei ligandi a Cl-II è impedito solo da RAP a concentrazioni che sono almeno 2 ordini di grandezza superiori a quelle richieste per l’inibizione del legame del ligando a LRP. I nostri risultati favoriscono i modelli che propongono l’inibizione allosterica indotta da RAP del legame del ligando a LRP che può richiedere moieties LRP che sono situati fuori Cl-II del recettore.