D Complex Formation
La formazione della protrombinasi definisce un importante evento di modulazione catalitica, perché il complesso completo è 300.000 volte più efficiente del fattore Xa libero che agisce sulla protrombina in soluzione.24,72 Un’implicazione di questo significativo aumento del tasso è che qualsiasi dissociazione di componenti dal complesso diminuisce significativamente e drasticamente l’attività dell’enzima. L’assenza della superficie della membrana dal catalizzatore completo risulta in una perdita di 1000 volte nell’efficienza catalitica, mentre l’eliminazione del fattore Va dal complesso risulta in una diminuzione di 10.000 volte nel tasso di generazione della trombina.24 La superficie della membrana è obbligatoriamente richiesta perché, sebbene contribuisca poco al tasso intrinseco di catalisi, fornisce un ambiente in cui sia il complesso fattore Va-fattore Xa che il substrato possono coconcentrarsi.277 La protrombina sembra concentrarsi sulla superficie della membrana piastrinica in larga parte attraverso i meccanismi mediati dai recettori descritti precedentemente. Il fattore Va, in virtù della sua capacità di legarsi alla membrana, forma un’interazione obbligatoria e ad alta affinità con il fattore Xa, perché il fattore Xa non si lega alle piastrine attivate in assenza del fattore Va. La concentrazione dei reagenti sulla superficie della membrana si traduce in alte concentrazioni locali di reagenti che superano il Km intrinseco della reazione e migliorano significativamente l’efficienza catalitica. Inoltre, il fattore Va aumenta il tasso di turnover della reazione con un meccanismo che non è stato ancora razionalizzato.278
La formazione del complesso offre anche ai costituenti della protrombinasi una protezione dagli inibitori e/o dagli inattivatori. In contrasto con il fattore Xa libero in soluzione, il fattore Xa incorporato nella protrombinasi (cioè complessato con il fattore Va legato alla membrana) è protetto dall’inibizione dell’antitrombina III e dell’eparina.72 Allo stesso modo, il fattore Va incorporato nella protrombinasi è protetto dall’inattivazione proteolitica della proteina attivata C109,110 – un processo che viene discusso in dettaglio nella sezione seguente.
La Xasi intrinseca è modulata da una varietà di meccanismi simili a quelli osservati con la protrombinasi. La formazione di complessi risulta in un aumento di circa 2 × 107 volte dell’efficienza catalitica.217 Il legame dei fattori VIIIa e IXaβ alle piastrine attivate dalla trombina diminuisce il Km per l’attivazione del fattore X di 2500 volte e permette al fattore VIIIa di aumentare il kcat di circa 7500 volte. L’antitrombina III non può inibire il fattore IXaβ in presenza del fattore VIIIa e delle piastrine.279 Similmente al fattore Va, la formazione di complessi del fattore VIIIa con il fattore IXaβ modula la sua attività. La dissociazione della subunità A2 dall’eterotrimeria del fattore VIIIa, che risulta in una perdita completa dell’attività del cofattore, è impedita dalla sua associazione con il fattore IXaβ su una superficie di membrana,280 così come la sua inattivazione da parte di APC.62,281
Perché il fattore Va è assolutamente necessario per la formazione di trombina fisiologicamente rilevante, variazioni significative nell’attivazione della protrombina possono essere realizzate attraverso alterazioni proteolitiche e inattivanti del cofattore catalizzate dalla proteina C attivata. La proteolisi e l’inattivazione richiedono che il fattore Va sia piastrinico59,74 o legato alla membrana.282 I primi studi indicavano che l’incubazione della proteina C attivata con piastrine attivate dalla trombina produceva una diminuzione parallela del legame del fattore Xa e dell’attivazione della protrombina, suggerendo che dopo la scissione da parte della proteina C attivata, il fattore Va non lega il fattore Xa.283,284 Quindi, l’inattivazione catalizzata dalla proteina C attivata del fattore Va ha un effetto drammatico sulla generazione di trombina.
Le piastrine umane sono in grado di promuovere e modulare l’inattivazione catalizzata dalla proteina C attivata del fattore Va derivato dal plasma e dalle piastrine, sebbene questi due pool di cofattori non siano substrati equivalenti per quanto riguarda l’inattivazione. Tre scissioni nella catena pesante della molecola del fattore Va umano sono necessarie per un’efficiente inattivazione catalizzata dalla proteina C attivata: La scissione ad Arg506, seguita dalle scissioni ad Arg306 e Arg679,282,285 La scissione ad Arg506 è più rapida e precede la scissione inattivante dipendente dalla membrana ad Arg306,282 La superficie piastrinica umana attivata dalla trombina gioca un ruolo importante nell’inattivazione catalizzata dalla proteina C attivata del fattore Va derivato dalle piastrine e della variante del fattore Va, fattore VaLeiden.109,110 Il fattore VaLeiden deriva dall’attivazione da parte della trombina del fattore VLeiden, una variante in cui Arg506 è stato sostituito da glutammina, rimuovendo essenzialmente il sito di scissione della proteina C attivata in posizione 506.286 Pertanto, gli individui omozigoti (e in alcuni casi eterozigoti) per questa mutazione subiscono una scarsa risposta anticoagulante alla proteina C attivata e sono a maggior rischio di trombosi venosa.287-289 I cofattori piastrinici normali e mutanti sono inattivati dalla proteina C attivata a tassi quasi identici; tuttavia, la completa inattivazione di entrambi i cofattori derivati dalle piastrine non è mai raggiunta,109,110 perché rimane fino al 50% dell’attività originale. Questi risultati sono in netto contrasto con quanto osservato negli studi sull’inattivazione catalizzata dalla proteina C attivata del fattore Va e del fattore VaLeiden derivati dal plasma su vescicole fosfolipidiche sintetiche.290-292 In questi studi, si osserva sempre la completa inattivazione dei cofattori, anche se il fattore VaLeiden del plasma viene inattivato a una velocità sostanzialmente più lenta del normale fattore Va del plasma. Negli studi sulle piastrine, una maggiore attività residua sia del fattore Va derivato dalle piastrine che del fattore VaLeiden rimane quando si usano piastrine attivate dalla trombina come superficie della membrana inattivante, quando si contrasta con la quasi completa inattivazione quando si usano vescicole fosfolipidiche sintetiche come superficie inattivante.110 Quindi, le piastrine attivate proteggono i cofattori derivati dalle piastrine dall’inattivazione catalizzata dalla proteina C attivata.109,110
Le piastrine attivate proteggono anche il normale fattore Va derivato dal plasma dall’inattivazione da parte della proteina C attivata rallentando la scissione a Arg506.110 Tuttavia, in contrasto con il cofattore derivato dalle piastrine, il fattore Va derivato dal plasma può essere completamente inattivato dalla proteina C attivata, suggerendo che i due diversi pool di cofattori (plasma vs. piastrine) sono diversi substrati per APC.110 Questi studi confermano nuovamente l’importanza degli eventi di legame nella modulazione dell’attività della protrombinasi. Dimostrano inoltre che le membrane fosfolipidiche piastriniche e sintetiche non sono superfici equivalenti nel regolare la formazione del complesso enzimatico. Collettivamente, questi studi indicano che le piastrine sostengono gli eventi procoagulanti fornendo una superficie di membrana che ritarda l’inattivazione del cofattore e rilasciando una molecola di cofattore che mostra un fenotipo resistente alla proteina C attivata.
È interessante considerare che, nei siti di lesione arteriosa, la mutazione del fattore VLeiden potrebbe non predire così facilmente la trombosi arteriosa, perché i cofattori derivati dalle piastrine normali e varianti sono ugualmente resistenti alla proteina C attivata sulla superficie piastrinica attivata. Infatti, il ruolo dimostrato della mutazione del fattore VLeiden nel predire la trombosi venosa287-289 può riflettere la resistenza documentata del cofattore VaLeiden derivato dal plasma rispetto al normale fattore Va derivato dal plasma.290-292 Il pool di cofattori del plasma può giocare un ruolo più significativo nella trombosi venosa a causa della mancanza di un contributo significativo delle piastrine. Al contrario, nel sito di un trombo arterioso, il cofattore derivato dalle piastrine, come risultato del suo rilascio e attivazione, può essere presente ad una concentrazione superiore a 600 volte quella del cofattore plasmatico.106