Microbiologie

Tijdens het proces van transcriptie, wordt de informatie die is gecodeerd in de DNA-sequentie van een of meer genen getranscribeerd in een streng RNA, ook wel een RNA-transcript genoemd. De resulterende enkelstrengs RNA-molecule, die is opgebouwd uit ribonucleotiden met de basen adenine (A), cytosine (C), guanine (G) en uracil (U), fungeert als een mobiele moleculaire kopie van de oorspronkelijke DNA-sequentie. Transcriptie in prokaryoten en in eukaryoten vereist dat de dubbele helix van het DNA gedeeltelijk wordt afgewikkeld in het gebied van de RNA-synthese. Het afgerolde gebied wordt een transcriptiebel genoemd. De transcriptie van een bepaald gen verloopt altijd vanaf één van de twee DNA-strengen die als sjabloon fungeert, de zogenaamde antisense streng. Het RNA-product is complementair aan de sjabloonstreng van het DNA en is bijna identiek aan de niet-sjabloonstreng van het DNA, of de sense-streng. Het enige verschil is dat in RNA alle T-nucleotiden zijn vervangen door U-nucleotiden; tijdens de RNA-synthese wordt U ingebouwd wanneer er een A in de complementaire antisensestreng zit.

Transcriptie bij Bacteriën

Bacteriën gebruiken hetzelfde RNA-polymerase voor de transcriptie van al hun genen. Net als DNA-polymerase voegt RNA-polymerase één voor één nucleotiden toe aan de 3′-OH-groep van de groeiende nucleotideketen. Een cruciaal verschil in activiteit tussen DNA-polymerase en RNA-polymerase is de eis voor een 3′-OH waaraan nucleotiden kunnen worden toegevoegd: DNA-polymerase heeft zo’n 3′-OH-groep nodig en heeft dus een primer nodig, terwijl RNA-polymerase dat niet heeft. Tijdens de transcriptie wordt een ribonucleotide dat complementair is aan de DNA-sjabloonstreng toegevoegd aan de groeiende RNA-streng en wordt door dehydratiesynthese een covalente fosfodiësterbinding gevormd tussen de nieuwe nucleotide en de laatst toegevoegde nucleotide. In E. coli bestaat RNA polymerase uit zes polypeptide-subeenheden, waarvan er vijf het polymerase-kernenzym vormen dat verantwoordelijk is voor het toevoegen van RNA-nucleotiden aan een groeiende streng. De zesde subeenheid staat bekend als sigma (σ). De σ-factor stelt RNA polymerase in staat zich aan een specifieke promotor te binden, waardoor de transcriptie van verschillende genen mogelijk wordt. Er zijn verschillende σ-factoren die de transcriptie van verschillende genen mogelijk maken.

Initiatie

De initiatie van de transcriptie begint bij een promotor, een DNA-sequentie waaraan de transcriptiemachine zich bindt en de transcriptie initieert. Het nucleotidenpaar in de dubbele helix van het DNA dat overeenkomt met de plaats van waaruit de eerste 5′ RNA-nucleotide wordt getranscribeerd, is de initiatieplaats. Nucleotiden die aan de initiatieplaats voorafgaan worden “upstream” genoemd, terwijl nucleotiden die op de initiatieplaats volgen “downstream”-nucleotiden worden genoemd. In de meeste gevallen bevinden promotors zich juist stroomopwaarts van de genen die zij reguleren. Hoewel promotorsequenties variëren tussen bacteriële genomen, zijn een paar elementen geconserveerd. Op de -10 en -35 posities in het DNA vóór de initiatieplaats (aangeduid als +1) zijn er twee promotor-consensussequenties, of regio’s die vergelijkbaar zijn in alle promotors en in verschillende bacteriële soorten. De -10 consensussequentie, die de TATA box wordt genoemd, is TATAAT. De -35-sequentie wordt herkend en gebonden door σ.

Elongatie

De elongatie in de transcriptiefase begint wanneer de σ-subeenheid zich losmaakt van het polymerase, waardoor het kernenzym RNA kan synthetiseren dat complementair is aan het DNA-sjabloon in een 5′ tot 3′-richting met een snelheid van ongeveer 40 nucleotiden per seconde. Tijdens de elongatie wordt het DNA voortdurend voor het kernenzym afgewikkeld en achter het kernenzym weer opgewikkeld (figuur 1).

Figuur 1. Tijdens de elongatie volgt het bacteriële RNA-polymerase het DNA-sjabloon, synthetiseert mRNA in de 5′ tot 3′-richting, en rolt het DNA af en terug terwijl het wordt afgelezen.

Terminatie

Als een gen eenmaal getranscribeerd is, moet het bacteriële polymerase zich losmaken van het DNA-sjabloon en het nieuw gemaakte RNA vrijmaken. Dit wordt beëindiging van de transcriptie genoemd. De DNA-sjabloon bevat herhaalde nucleotide-sequenties die fungeren als beëindigingssignalen, waardoor RNA polymerase afslaat en zich losmaakt van de DNA-sjabloon, waardoor het RNA transcript vrijkomt.

Transcriptie bij Eukaryoten

Prokaryoten en eukaryoten voeren fundamenteel hetzelfde proces van transcriptie uit, met een paar belangrijke verschillen (zie Tabel 1). Eukaryoten gebruiken drie verschillende polymerasen, de RNA polymerasen I, II en III, die alle structureel verschillen van de bacteriële RNA polymerase. Elk transcribeert een andere subset van genen. Interessant is dat archaea één RNA-polymerase bevatten die nauwer verwant is aan eukaryotische RNA-polymerase II dan aan zijn bacteriële tegenhanger. Eukaryote mRNA’s zijn gewoonlijk ook monocistronisch, wat betekent dat zij elk slechts voor één enkel polypeptide coderen, terwijl prokaryote mRNA’s van bacteriën en archaea gewoonlijk polycistronisch zijn, wat betekent dat zij voor meerdere polypeptiden coderen.

Het belangrijkste verschil tussen prokaryoten en eukaryoten is de membraan-gebonden kern van de laatste, die van invloed is op het gemak waarmee RNA moleculen voor eiwitsynthese kunnen worden gebruikt. Terwijl de genen in een kern gebonden zijn, moet de eukaryote cel eiwitcoderende RNA-moleculen naar het cytoplasma transporteren om te worden vertaald. Eiwitcoderende primaire transcripten, de RNA-moleculen die rechtstreeks door RNA-polymerase worden gesynthetiseerd, moeten verschillende bewerkingsstappen ondergaan om deze RNA-moleculen tegen afbraak te beschermen gedurende de tijd dat zij van de kern naar het cytoplasma worden overgebracht en in een eiwit worden vertaald. Zo kunnen eukaryote mRNA’s verscheidene uren meegaan, terwijl het typische prokaryote mRNA niet meer dan 5 seconden meegaat.

Het primaire transcript (ook wel pre-mRNA genoemd) wordt eerst bekleed met RNA-stabiliserende eiwitten om het te beschermen tegen afbraak terwijl het wordt verwerkt en uit de kern wordt geëxporteerd. De eerste vorm van verwerking begint terwijl het primaire transcript nog wordt gesynthetiseerd; een speciaal 7-methylguanosine nucleotide, de 5′ cap genoemd, wordt toegevoegd aan het 5′ einde van het groeiende transcript. De cap voorkomt niet alleen afbraak, maar wordt ook herkend door factoren die betrokken zijn bij de daaropvolgende eiwitsynthese, waardoor de translatie door ribosomen op gang komt. Zodra de rek is voltooid, voegt een ander verwerkingsenzym een reeks van ongeveer 200 adenine-nucleotiden toe aan het 3′-uiteinde, de poly-A-staart genoemd. Deze modificatie beschermt het pre-mRNA verder tegen afbraak en geeft aan cellulaire factoren het signaal dat het transcript naar het cytoplasma moet worden geëxporteerd.

Eukaryote genen die coderen voor polypeptiden zijn opgebouwd uit coderende sequenties die exonen worden genoemd (ex-on geeft aan dat ze tot expressie worden gebracht) en tussenliggende sequenties die introns worden genoemd (int-ron geeft aan dat ze een tussenliggende rol spelen). Getranscribeerde RNA-sequenties die overeenkomen met introns coderen niet voor delen van het functionele polypeptide en worden tijdens de verwerking uit het pre-mRNA verwijderd. Het is van essentieel belang dat alle intron-gecodeerde RNA-sequenties vóór de eiwitsynthese volledig en nauwkeurig uit een pre-mRNA worden verwijderd, zodat de exon-gecodeerde RNA-sequenties op de juiste wijze worden samengevoegd om voor een functioneel polypeptide te coderen. Indien dit proces ook maar één nucleotide foutief verloopt, zullen de sequenties van de samengevoegde exonen verschuiven en zal het resulterende polypeptide niet functioneel zijn. Het proces waarbij intron-gecodeerde RNA-sequenties worden verwijderd en de door exonen gecodeerde sequenties weer aan elkaar worden gekoppeld, wordt RNA-splicing genoemd en wordt vergemakkelijkt door de werking van een spliceosoom dat kleine nucleaire ribonucleo-eiwitten (snRNPs) bevat. Intron-gecodeerde RNA-sequenties worden uit het pre-mRNA verwijderd terwijl dit zich nog in de kern bevindt. Hoewel zij niet worden vertaald, blijken introns diverse functies te hebben, waaronder genregulatie en mRNA-transport. Na voltooiing van deze modificaties wordt het rijpe transcript, het mRNA dat voor een polypeptide codeert, uit de kern getransporteerd, bestemd voor vertaling in het cytoplasma. Introns kunnen verschillend worden gespliced, waardoor verschillende exonen al dan niet in het uiteindelijke mRNA-product worden opgenomen. Dit proces staat bekend als alternatieve splicing. Het voordeel van alternatieve splicing is dat verschillende soorten mRNA-transcripten kunnen worden gegenereerd, die alle van dezelfde DNA-sequentie zijn afgeleid. De laatste jaren is aangetoond dat sommige archaea ook in staat zijn hun pre-mRNA te splitsen.