D-komplexbildning
Protrombinasbildningen definierar en viktig modulerande händelse katalytiskt, eftersom det kompletta komplexet är 300 000 gånger effektivare än fri faktor Xa som agerar på protrombin i lösning.24,72 En konsekvens av denna betydande ökning av hastigheten är att varje dissociering av komponenter från komplexet minskar enzymaktiviteten avsevärt och drastiskt. Avsaknaden av membranytan från den kompletta katalysatorn resulterar i en 1000-faldig förlust av katalytisk effektivitet, medan borttagning av faktor Va från komplexet resulterar i en 10 000-faldig minskning av hastigheten för trombingenerering.24 Membranytan är obligatoriskt nödvändig eftersom den, även om den bidrar föga till den inneboende katalyshastigheten, tillhandahåller en miljö där både faktor Va-faktor Xa-komplexet och substratet kan samkoncentrera sig.277 Protrombin tycks koncentrera sig vid trombocytmembranytan till stor del genom de receptormedierade mekanismer som beskrivits tidigare. Faktor Va bildar genom sin membranbindningskapacitet en obligatorisk och hög affinitetsinteraktion med faktor Xa, eftersom faktor Xa inte kommer att binda till aktiverade trombocyter i avsaknad av faktor Va. Koncentration av reaktanter vid membranytan resulterar i höga lokala koncentrationer av reagenser som överstiger reaktionens inneboende Km och avsevärt förbättrar den katalytiska effektiviteten. Dessutom ökar faktor Va omsättningshastigheten för reaktionen genom en mekanism som ännu inte har rationaliserats.278
Komplexbildning ger också protrombinasbeståndsdelarna skydd mot hämmare och/eller inaktivatorer. Till skillnad från faktor Xa fri i lösning är faktor Xa inkorporerad i protrombinas (dvs. komplexerad med membranbunden faktor Va) skyddad från hämning av antitrombin III och heparin.72 På samma sätt är faktor Va inkorporerad i protrombinas skyddad från proteolytisk inaktivering av aktiverat protein C109,110 – en process som diskuteras i detalj i följande avsnitt.
Intrinskt Xas moduleras av en mängd olika mekanismer som liknar dem som observerats med protrombinas. Komplexbildning resulterar i en ungefär 2 × 107-faldig ökning av den katalytiska effektiviteten.217 Bindningen av faktorerna VIIIa och IXaβ till trombinaktiverade trombocyter minskar Km för faktor X-aktivering 2500-faldigt och gör det möjligt för faktor VIIIa att öka kcat ungefär 7500-faldigt. Antitrombin III kan inte hämma faktor IXaβ i närvaro av faktor VIIIa och trombocyter.279 I likhet med faktor Va modulerar komplexbildningen av faktor VIIIa med faktor IXaβ dess aktivitet. Dissociationen av A2-underenheten från heterotrimerfaktorn VIIIa, som resulterar i en fullständig förlust av kofaktoraktivitet, förhindras av dess förening med faktor IXaβ på en membranyta280 , liksom dess inaktivering av APC62,281 .
Då faktor Va är absolut nödvändig för fysiologiskt relevant trombinbildning, kan betydande variationer i protrombinaktivering åstadkommas via proteolytiska, inaktiverande förändringar i kofaktorn som katalyseras av aktiverat protein C. Proteolys och inaktivering kräver att faktor Va är trombocyt59,74 eller membranbunden.282 Tidiga studier visade att inkubation av aktiverat protein C med trombinaktiverade trombocyter gav en parallell minskning av faktor Xa-bindning och protrombinaktivering, vilket tyder på att faktor Va efter klyvning av aktiverat protein C inte binder faktor Xa283,284 . Därför har aktiverat protein C-katalyserad inaktivering av faktor Va en dramatisk effekt på trombinbildningen.
Humana trombocyter kan främja och modulera den aktiverade protein C-katalyserade inaktiveringen av plasma- och trombocytavledd faktor Va, även om dessa två kofaktorpooler inte är likvärdiga substrat med avseende på inaktivering. Tre klyvningar i den tunga kedjan av den humana faktor Va-molekylen krävs för effektiv aktiverat protein C-katalyserad inaktivering: Klyvning vid Arg506, följt av klyvningar vid Arg306 och Arg679,282,285 Klyvningen vid Arg506 är snabbare och föregår den membranberoende, inaktiverande klyvningen vid Arg306,282 Den trombinaktiverade, mänskliga trombocytytan spelar en viktig roll i den aktiverade protein C-katalytiska inaktiveringen av trombocytavledd faktor Va och faktor Va-varianten, faktor VaLeiden.109,110 Faktor VaLeiden härrör från trombinaktivering av faktor VLeiden, en variant där Arg506 har ersatts med glutamin, vilket i huvudsak tar bort klyvningsstället för aktiverat protein C vid position 506.286 Personer som är homozygota (och i vissa fall heterozygota) för denna mutation har således ett dåligt antikoagulanssvar på aktiverat protein C och löper en ökad risk för venös trombos.287-289 De normala och muterade trombocytkofaktorerna inaktiveras av aktiverat protein C med nästan identiska hastigheter; fullständig inaktivering av båda de trombocytavledda kofaktorerna uppnås dock aldrig,109,110 eftersom så mycket som 50 % av den ursprungliga aktiviteten kvarstår. Dessa resultat står i tydlig kontrast till vad som har observerats i studier av den aktiverade protein C-katalyserade inaktiveringen av plasmaderiverad faktor Va och faktor VaLeiden på syntetiska fosfolipidvesiklar.290-292 I dessa studier observeras alltid fullständig inaktivering av kofaktorerna, även om plasmafaktor VaLeiden inaktiveras i en betydligt långsammare takt än normal plasmafaktor Va. I studier av trombocyter kvarstår större kvarvarande aktivitet av både trombocytavledd faktor Va och faktor VaLeiden när man använder trombinaktiverade trombocyter som inaktiverande membranyta, i motsats till den nästan fullständiga inaktiveringen när syntetiska fosfolipidvesiklar används som inaktiverande yta.110 Aktiverade trombocyter skyddar alltså de trombocytavledda kofaktorerna från aktiverat protein C-katalyserad inaktivering109,110 .
Aktiverade trombocyter skyddar också den normala plasmaderiverade faktorn Va från inaktivering genom aktiverat protein C genom att bromsa klyvningen vid Arg506.110 I motsats till den trombocyteriverade kofaktorn kan dock plasmaderiverad faktor Va inaktiveras fullständigt av aktiverat protein C, vilket tyder på att de två olika kofaktorpooler (plasma vs. trombocyter) är olika substrat för APC.110 Dessa studier bekräftar återigen betydelsen av bindningshändelser för att modulera protrombinasaktiviteten. De visar också att trombocytmembran och syntetiska fosfolipidmembran inte är likvärdiga ytor när det gäller att reglera bildandet av enzymkomplex. Sammantaget tyder dessa studier på att trombocyter upprätthåller prokoagulanta händelser genom att tillhandahålla en membranyta som fördröjer kofaktorinaktivering och genom att frigöra en kofaktormolekyl som uppvisar en fenotyp som är motståndskraftig mot aktiverat protein C.
Det är intressant att tänka på att vid platser med arteriell skada kanske faktor VLeiden-mutationen inte lika lätt kan förutsäga arteriell trombos, eftersom de normala och varianterade trombocytära kofaktorerna är lika motståndskraftiga mot aktiverat protein C vid den aktiverade trombocytens yta. Faktum är att den påvisade rollen för faktor VLeiden-mutationen när det gäller att förutsäga venös trombos287-289 kan återspegla den dokumenterade resistensen hos den plasmagenererade kofaktorn faktor VaLeiden jämfört med normal, plasmagenererad faktor Va.290-292 Plasmakofaktorpoolen kan spela en viktigare roll vid venös trombos på grund av avsaknaden av ett betydande bidrag från trombocyterna. På platsen för en arteriell trombos kan däremot den trombocytavledda kofaktorn, som ett resultat av dess frisättning och aktivering, finnas i en koncentration som är mer än 600 gånger högre än plasmakofaktorns.106
.