Det lipoproteinreceptorrelaterade proteinet med låg densitet (LRP), en medlem av genfamiljen för lipoproteinreceptorer med låg densitet, medierar det cellulära upptaget av en mångfald av ligander. En vikande chaperon, det 39 kDa receptorassocierade proteinet (RAP) som finns i de tidiga delarna av den sekretoriska vägen, hämmar bindningen av alla ligander till receptorn och kan tjäna till att förhindra för tidig bindning av ligander till receptorn under trafiken till cellytan. För att belysa de molekylära interaktioner som ligger till grund för samspelet mellan receptorn, RAP och liganderna har vi analyserat och avgränsat bindningsställena för plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1), plasminogenaktivator av vävnadstyp (t-PA).PAI-1-komplex, RAP och anti-LRP Fab-fragmentet Fab A8. För detta ändamål har vi genererat en serie lösliga rekombinanta fragment som spänner över det andra klustret av komplementtyprepetitioner (C3-C10) och den aminoterminala flankerande epidermala tillväxtfaktorrepetitionen (E4) av LRP (E4-C10; aminosyror 787-1165). Alla fragment uttrycktes av stabilt transfekterade njurceller från babyhamster och renades genom affinitetskromatografi. En detaljerad studie av ligandbindning till fragmenten med hjälp av ytplasmonresonans avslöjade närvaron av tre distinkta, Ca2+-beroende ligandbindningsställen i LRP:s kluster II-domän (Cl-II). t-PA.PAI-1-komplex och PAI-1 binder till en domän som är belägen i den aminoterminala delen av Cl-II och som sträcker sig över upprepningarna E4-C3-C7. I anslutning till denna plats och delvis överlappande finns en RAP-bindningsplats med hög affinitet som är belägen på repetitionerna C5-C7. Fab A8, en pseudoligand för receptorn, binder till en tredje Ca2+ -beroende bindningsplats på repetitionerna C8-C10 i den karboxylterminala delen av Cl-II. Därefter studerade vi den RAP-medierade hämmningen av ligandbindning till LRP och till Cl-II. Som förväntat observerade vi en stark inhibering av t-PA.PAI-1-komplexet och Fab A8-bindning till LRP av RAP (IC50 överensstämmer med 0,3 nM), medan vi i det omvända experimentet observerade konkurrens av t-PA. PAI-1-komplex och Fab A8 för RAP-bindning till LRP endast kunde påvisas vid höga koncentrationer av konkurrenterna (>/=1 microM). Intressant nog, även om jämviktsdissociationskonstanterna för RAP:s bindning till LRP och Cl-II är likartade, förhindras bindningen av liganderna till Cl-II av RAP endast vid koncentrationer som är minst två storleksordningar högre än de som krävs för att hämma ligandernas bindning till LRP. Våra resultat gynnar modeller som föreslår RAP-inducerad allosterisk hämning av ligandbindning till LRP som kan kräva LRP-grupper som är belägna utanför Cl-II av receptorn.