La proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (PRL), un miembro de la familia de genes del receptor de lipoproteínas de baja densidad, media la captación celular de una diversidad de ligandos. Una chaperona plegable, la proteína asociada al receptor (RAP) de 39 kDa, que reside en los primeros compartimentos de la vía secretora, inhibe la unión de todos los ligandos al receptor y puede servir para evitar la unión prematura de los ligandos al receptor durante el tráfico a la superficie celular. Para dilucidar las interacciones moleculares que subyacen a la interacción entre el receptor, el RAP y los ligandos, hemos analizado y delineado los sitios de unión del inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1), los complejos activador del plasminógeno de tipo t-PA.PAI-1, el RAP y el fragmento Fab A8 anti-LRP. Para ello, hemos generado una serie de fragmentos recombinantes solubles que abarcan el segundo grupo de repeticiones de tipo complemento (C3-C10) y la repetición aminoterminal del factor de crecimiento epidérmico (E4) de la PRL (E4-C10; aminoácidos 787-1165). Todos los fragmentos se expresaron mediante células de riñón de hámster bebé transfectadas de forma estable y se purificaron mediante cromatografía de afinidad. Un estudio detallado de la unión del ligando a los fragmentos mediante resonancia de plasmón de superficie reveló la presencia de tres sitios de unión del ligando distintos y dependientes del Ca2+ en el dominio del cluster II (Cl-II) de la PRL. Los complejos t-PA.PAI-1 así como el PAI-1 se unen a un dominio localizado en la porción amino-terminal del Cl-II, que abarca las repeticiones E4-C3-C7. Adyacente a este sitio y parcialmente superpuesto hay un sitio de unión a RAP de alta afinidad situado en las repeticiones C5-C7. El Fab A8, un pseudo-ligando del receptor, se une a un tercer sitio de unión dependiente de Ca2+ en las repeticiones C8-C10 en el extremo carboxilo-terminal de Cl-II. A continuación, estudiamos la inhibición mediada por RAP de la unión del ligando a la PRL y a la Cl-II. Como se esperaba, observamos una fuerte inhibición de la unión del complejo t-PA.PAI-1 y del Fab A8 a la PRL por parte de la RAP (IC50 congruente con 0,3 nM), mientras que en el experimento inverso, la competencia de los complejos t-PA. PAI-1 y Fab A8 por la unión de RAP a la PRL sólo pudo demostrarse a altas concentraciones de competidores (>/=1 microM). Curiosamente, aunque las constantes de disociación de equilibrio para la unión de la RAP a la PRL y a la Cl-II son similares, la unión de los ligandos a la Cl-II sólo es impedida por la RAP a concentraciones que son al menos 2 órdenes de magnitud superiores a las requeridas para la inhibición de la unión del ligando a la PRL. Nuestros resultados favorecen los modelos que proponen la inhibición alostérica inducida por RAP de la unión del ligando a la PRL que puede requerir motivos de la PRL que están localizados fuera del Cl-II del receptor.