Mikä on sivuvirtausimmunomääritys?
Immunokromatografian periaatteisiin perustuvia sivuvirtaustestiliuskoja on olemassa monille kohdeanalyyteille. Ensimmäiset testit on tehty ihmisen koriongonadotropiinin (hCG) osoittamiseksi. Nykyään on kaupallisesti saatavilla testejä ovulaation seurantaan, tartuntatautien havaitsemiseen, huumeiden väärinkäytön analysointiin ja muiden ihmisen fysiologian kannalta tärkeiden analyyttien mittaamiseen. Tuotteita on tuotu markkinoille myös testausta, maataloussovelluksia, ympäristötestausta ja elintarvikkeiden & rehujen testausta varten.
Vaikka ensimmäisissä testeissä esitettiin kvalitatiivisia tuloksia, jotka perustuivat signaaliviivan olemassaoloon tai puuttumiseen, testien suunnittelu on edennyt kohti semikvantitatiivisia ja kvantitatiivisia määrityksiä ja käsikäyttöisten lukulaitteiden integrointia.
Sivuvirtausimmunomääritys kuvataan eri sektoreilla ja eri maissa käyttäen vaihtelevaa terminologiaa. Yleisiä nimityksiä ovat mm:
+ Sivuvirtausimmunomääritys (LFIA)
+ Sivuvirtaustesti (LFT)
+ Sivuvirtauslaite (LFD)
+ Sivuvirtausmääritys (LFA)
+ Sivuvirtausimmunokromatografia. assays
+ Dipstick
+ Pikatesti
+ Testiliuska
+ Pikatesti
+ Pikatesti
Sivuvirtausmääritykset voidaan kehittää käytettäväksi dipstick-muodossa tai kasetissa. Sekä dipstick- että kasettitestit toimivat samalla tavalla, riippuu vain toimialasta, näytematriisista ja markkinoiden vaatimuksista, kumpi formaatti on sopiva.
Sandwich-muoto
Sandwich-muotoista määritysmuotoa käytetään tyypillisesti suhteellisen suurten analyyttien osoittamiseen. Jos analyytillä on vähintään kaksi erillistä sitoutumiskohtaa (eli epitooppia), voidaan kehittää ”sandwich”-määritys, jossa yhden epitoopin vasta-aine konjugoidaan nanopartikkeliin ja toisen epitoopin vasta-aine immobilisoidaan testilinjalle. Sandwich-formaatti johtaa signaalin intensiteettiin, joka on verrannollinen näytteessä olevan analyytin määrään.
Kompetitiivinen formaatti
Kilpailullista formaattia käytetään sellaisten analyyttien havaitsemiseen, joissa analyytti on liian pieni kahden vasta-aineen yhtäaikaiseen sitoutumiseen, kuten vitamiinit ja antibiootit. Kompetitiivisessa määrityksessä testilinja sisältää kohdeanalyytin molekyylin (yleensä proteiini-analyytti-kompleksin). Nanopartikkelit on konjugoitu vasta-aineeseen, joka tunnistaa analyytin. Jos näytteessä ei ole analyyttiä, nanopartikkelien vasta-ainekonjugaatit sitoutuvat analyyttiin testilinjalla, jolloin signaalin intensiteetti on suuri. Jos kohdeanalyyttiä on näytteessä, analyytti sitoutuu nanohiukkasen pinnalla oleviin vasta-aineisiin ja estää nanohiukkasta sitoutumasta testilinjaan. Tämä vähentää signaalia testilinjalla, mikä johtaa signaalin intensiteettiin, joka on kääntäen verrannollinen näytteessä olevan analyytin määrään.
Sivuvirtausimmunomääritystekniikassa käytetään nitroselluloosakalvoa, värillisiä nanohiukkasia (tai leimoja) ja tyypillisesti vasta-aineita tulosten tuottamiseen.
Kun näyte lisätään, näyte virtaa testilaitetta pitkin kulkien konjugaattityynyn läpi nitroselluloosamembraaniin ja sen jälkeen absorboivalle tyynytyynylle.
Alla olevassa kuvassa havainnollistetaan, miten sandwich-assay toimii:
Näytetyyny: Toimii absorptioprosessin ensimmäisenä vaiheena, ja joissakin tapauksissa se sisältää suodattimen näytteen tarkan ja hallitun virtauksen varmistamiseksi.
Konjugaattityyny: Säilyttää konjugoidut leimat ja vasta-aineet, vastaanottaa näytteen. auttaa uudelleen liuotetun konjugaatin kontrolloidussa vapautumisessa nitroselluloosamembraanille.
Nitroselluloosamembraani: Tarjoaa ihanteellisen kiinteän faasin testi- ja kontrollilinjan reagenssien immobilisointiin. Kun näyte liikkuu laitetta pitkin, nitroselluloosakalvolla olevat sitovat reagenssit sitoutuvat testilinjalla olevaan kohteeseen. Syntyy värillinen viiva, jonka tiheys vaihtelee kohteen määrän mukaan.
Adsorbenttityyny: Tarjoaa tasaisen kapillaarivirtauksen kalvon läpi, imee levitetyn näytteen ja estää takaisinvirtauksen.
Näytematriisit
Kohdeanalyytti ja markkinoiden vaatimukset määrittävät, minkä tyyppistä näytettä käytetään määrityksessä.
Jotkut näytteet vaativat juoksutuspuskuria näytteen kuljettamisen helpottamiseksi, esim. eläinten rehu. Toiset näytteet, kuten veri, seerumi, virtsa tai sylki, voidaan ehkä sijoittaa suoraan testiin, kun taas joissakin tapauksissa tarvitaan laimennuspuskuria.
Sivuvirtausimmunomääritykset on kehitetty kohdeanalyyttien havaitsemiseen näytematriiseista, joita ovat:
1. Maito
2. Kokoveri
3. Seerumi
4. Sylki
5. Virtsa
6. Kudosnäytteet
7. Ruoka
8. Juoma
9. Rehu
10. Kasvimateriaali
11. Vesi
Merkintätyypit
Tyypillisesti lateraalivirtausmäärityksissä käytetään konjugoituja kulta-nanohiukkasia konjugaattityynyssä. Muita leimoja ovat esimerkiksi värilliset polystyreenihelmet, magneettihelmet, kvanttipisteet tai ylöskonvertoivat nanopartikkelit.
Määrityksen optimoinnilla varmistetaan, että leima vuorovaikuttaa oikealla tavalla vasta-aineen ja antigeenin kanssa, jotta varmistetaan tulosten tehokkuus ja tarkkuus.
Monitehoiset lateraalivirtausmääritykset
Kaikki sandwich- ja kilpailevat määritykset voidaan kehittää siten, että ne sisältävät yhden tai useamman testilinjan.
Multipleksoitua määritystä voidaan käyttää:
Monien kohteiden havaitsemiseen yhdellä testillä sen sijaan, että käytettäisiin monia yksittäisiä testejä. Tilanteissa, joissa käytettävissä on vain pieni näytemäärä, multipleksitesti mahdollistaa sen käytön maksimoimisen;
Tukemaan diagnoosia, kun tarvitaan useiden merkkiaineiden esiintymistä yhdessä;
Vahvistamaan useiden kontaminanttien esiintyminen suuren määrän elintarvike- ja rehutesteissä;
Tarjoamalla kustannussäästöhyötyjä loppukäyttäjille laboratoriossa tai kentällä testaamalla useita kohteita samanaikaisesti;
Kaukana sijaitsevilla alueilla tai maatalousalueilla, joilla resursseja on rajoitetusti ja joissa multipleksitestaus säästää aikaa.
Kvantitatiiviset nopeat lateraalivirtauslaitteet
LFD-laitteiden varhaiset versiot olivat pääasiassa kvalitatiivisia määrityksiä. Parannukset reagensseissa, komponenttimateriaaleissa ja lukijateknologioissa sekä valmistusprosesseissa merkitsevät kuitenkin sitä, että kvantitatiiviset tulokset ovat saavutettavissa.
Lukijateknologian kehittyminen ja raaka-aineiden, kuten etikettien, kehittyminen merkitsevät sitä, että sivuvirtauksen pikatesti voi vastata ELISA-määrityksen herkkyyttä.
Edut & Sivuvirtausimmunomääritysten haitat
| Edut | Haitat |
| Matalat kustannukset | Kvantitatiivinen tai semi-kvantitatiivinen lukema |
| Laaja sovellusalue | Testin kokonaistilavuuden rajoittaminen voi rajoittaa herkkyyttä |
| Vakiintunut tekniikka, Helppo valmistaa | Epätarkka näytemäärä voi vähentää tarkkuutta |
| Pitkä säilyvyysaika, ei jäähdytystarvetta | Testien välinen uusittavuus voi olla ongelmallista |
| Yksinkertainen, käyttäjäystävällinen käyttö | vaikea pienentää näytemäärää |
| korkea herkkyys ja spesifisyys | Multipleksointi voi olla haastavaa |
| Tarvitaan pieni näytemäärä | epäselvä patenttitilanne joissakin tapauksissa |
| Yksivaiheinen määritys, ei tarvita pesuvaiheita, lyhyt aika tulokseen | |
| Suhteellisen lyhyt kehitysaika, Markkinoille tuloaika lyhenee | |
| Suuri kaupallistamispotentiaali | |
| Helppo skaalautuvuus | |
| Voidaan integroida lukijajärjestelmiin | |
| Mahdollisuus multipleksointiin |
- Edut :
Matalat kustannukset
Laaja sovellusalue
Vakiintunut teknologia, helppo valmistaa
Pitkä säilyvyysaika, ei jäähdytystarvetta
Yksinkertainen, käyttäjäystävällinen käyttö
Korkea herkkyys ja spesifisyys
Matalan näytemäärän tarve
Yksivaiheinen määritys, ei tarvita pesuvaiheita, lyhyt aika tulokseen
Suhteellisen lyhyt kehitysaika, aika markkinoille saattamiseen lyhenee
Suuri kaupallistamispotentiaali
Helppo skaalautuvuus
Voidaan integroida lukulaitejärjestelmiin
Mahdollisuus multipleksointiin - Haitat :
Kvalitatiivinen tai semi-kvantitatiivinen luenta
Kokonaistestimäärän rajoittaminen voi rajoittaa herkkyyttä
Tarkka näytemäärä voi heikentää tarkkuutta
Testien välinen uusittavuus voi olla ongelmallista
Näytemäärän pienentäminen on vaikeaa
Multipleksointi voi olla haastavaa
epäselvä patenttitilanne joissakin tapauksissa