D Complex Formation
Prothrombinase formation define um importante evento modulador catalítico, porque o complexo completo é 300.000 vezes mais eficiente que o fator livre Xa atuando sobre a protrombina em solução.24,72 Uma implicação deste aumento significativo da taxa é que qualquer dissociação dos componentes do complexo diminui significativa e drasticamente a atividade enzimática. A ausência da superfície da membrana do catalisador completo resulta em uma perda de 1000 vezes na eficiência catalítica, enquanto que a eliminação do fator Va do complexo resulta em uma diminuição de 10.000 vezes na taxa de geração de trombina.24 A superfície da membrana é obrigatoriamente necessária porque, embora contribuindo pouco para a taxa intrínseca de catálise, ela fornece um ambiente no qual tanto o complexo fator Va-fator Xa quanto o substrato podem coconcentrar.277 A protrombina parece concentrar-se na superfície da membrana plaquetária em grande parte através dos mecanismos mediados pelo receptor detalhados anteriormente. O fator Va, em virtude de sua capacidade de ligação da membrana, forma uma interação obrigatória e de alta afinidade com o fator Xa, pois o fator Xa não se ligará às plaquetas ativadas na ausência do fator Va. A concentração de reagentes na superfície da membrana resulta em altas concentrações locais de reagentes que excedem o Km intrínseco da reação e melhoram significativamente a eficiência catalítica. Além disso, o fator Va aumenta a taxa de rotação da reação por um mecanismo que ainda não foi racionalizado.278
Formação complexa também oferece proteção aos constituintes protrombinase contra inibidores e/ou inativadores. Ao contrário do fator Xa livre em solução, o fator Xa incorporado à protrombinase (ou seja, complexado com fator Va ligado à membrana) é protegido da inibição pela antitrombina III e heparina.72 Da mesma forma, o fator Va incorporado à protrombinase é protegido da inativação proteolítica pela proteína C109.110 – um processo que é discutido em detalhes na seção seguinte.
A Xase intrínseca é modulada por uma variedade de mecanismos similares aos observados com a protrombinase. A formação complexa resulta em um aumento aproximado de 2 × 107 vezes na eficiência catalítica.217 A ligação dos fatores VIIIa e IXaβ às plaquetas ativadas por trombina diminui o Km para ativação do fator X 2500 vezes e permite que o fator VIIIa aumente o kcat aproximadamente 7500 vezes. O antitrombina III não pode inibir o fator IXaβ na presença do fator VIIIa e plaquetas.279 Assim como o fator Va, a formação complexa do fator VIIIa com o fator IXaβ modula a sua atividade. A dissociação da subunidade A2 do fator VIIIa heterotrimeiro, que resulta em perda completa da atividade do co-fator, é evitada pela associação com o fator IXaβ em uma superfície de membrana,280 assim como sua inativação pelo APC.62.281
Porque o fator Va é absolutamente necessário para a formação de trombina fisiologicamente relevante, variações significativas na ativação da protrombina podem ser realizadas via proteolítica, inativando alterações no co-fator catalisado pela proteína C ativada. A proteólise e a inativação requerem que o fator Va seja plaquetário59,74 ou ligado à membrana.282 Estudos iniciais indicaram que a incubação da proteína C ativada com plaquetas ativadas por trombina produziu uma diminuição paralela da ligação do fator Xa e da ativação da protrombina, sugerindo que, após a clivagem pela proteína C ativada, o fator Va não liga o fator Xa.283.284 Assim, a inativação catalisada da proteína C ativada do fator Va tem um efeito dramático na geração de trombina.
As plaquetas humanas são capazes de promover e modular a inativação catalisada da proteína C ativada do fator Va derivado de plasma e plaquetas, embora estes dois pools de co-fatores não sejam substratos equivalentes no que diz respeito à inativação. Três clivagens na cadeia pesada da molécula de fator Va humana são necessárias para a inativação eficiente da proteína ativada C-catalítica: clivagem em Arg506, seguida por clivagens em Arg306 e Arg679.282.285 A clivagem em Arg506 é mais rápida e precede a clivagem dependente da membrana, inactivando a clivagem em Arg306.282 A superfície plaquetária humana activada por trombina desempenha um papel importante na inactivação da proteína activada C-catalítica do factor Va derivado das plaquetas e da variante do factor Va, factor VaLeiden.109,110 O fator VaLeiden é derivado da ativação da trombina do fator VLeiden, uma variante na qual Arg506 foi substituída pela glutamina, essencialmente removendo o local de clivagem da proteína C ativada na posição 506.286 Assim, indivíduos homozigotos (e, em alguns casos, heterozigotos) para esta mutação sofrem uma resposta anticoagulante deficiente à proteína C ativada e estão em risco aumentado de trombose venosa.287-289 Os co-fatores plaquetários normais e mutantes são inativados pela proteína C ativada a taxas quase idênticas; entretanto, a inativação completa de ambos os co-fatores derivados de plaquetas nunca é alcançada,109.110 porque até 50% da atividade original permanece. Estes resultados estão em contraste marcante com o que foi observado em estudos de inativação da proteína C-catalítica ativada de fator Va e fator VaLeiden em vesículas de fosfolípidos sintéticos.290-292 Nestes estudos, a inativação completa dos cofatores é sempre observada, embora o fator VaLeiden seja inativado a uma taxa substancialmente mais lenta do que o fator Va normal do plasma. Nos estudos plaquetários, maior atividade residual tanto do fator VaLeiden quanto do fator VaLeiden derivados de plaquetas permanece quando se usa plaquetas ativadas por trombina como superfície da membrana inativadora, quando contrastado com a inativação quase completa quando vesículas fosfolipídicas sintéticas são usadas como superfície inativadora.110 Assim, plaquetas ativadas protegem os co-fatores derivados de plaquetas da inativação da proteína C-catalítica ativada.109,110
Plaquetas ativadas também protegem o fator Va derivado do plasma normal da inativação pela proteína C ativada, diminuindo a clivagem em Arg506.110 Entretanto, ao contrário do cofator derivado de plaquetas, o fator Va derivado do plasma pode ser completamente inativado pela proteína C ativada, sugerindo que os dois diferentes pools de cofator (plasma vs. plaquetas) são substratos diferentes para APC.110 Estes estudos confirmam novamente a importância dos eventos de ligação na modulação da atividade protrombinase. Eles também demonstram que as membranas plaquetárias e fosfolipídicas sintéticas não são superfícies equivalentes na formação do complexo enzimático regulador. Coletivamente, estes estudos indicam que as plaquetas sustentam eventos procoagulantes fornecendo uma superfície de membrana que retarda a inativação do co-fator e liberando uma molécula co-fator que exibe um fenótipo resistente à proteína C ativada.
É interessante considerar que, nos locais de lesão arterial, a mutação do fator VLeiden pode não prever tão prontamente a trombose arterial, pois os co-fatores normais e derivados de plaquetas são igualmente resistentes à proteína C ativada na superfície plaquetária ativada. De fato, o papel demonstrado da mutação do fator VLeiden na previsão de trombose venosa287-289 pode refletir a resistência documentada do cofator VaLeiden derivado do plasma em comparação com o fator Va.290-292 normal, derivado do plasma. Em contraste, no local de um trombo arterial, o cofactor derivado de plaquetas, como resultado da sua libertação e activação, pode estar presente a uma concentração superior a 600 vezes a do cofactor plasmático.106