D Complex Formation
Prothrombinase dannelse definerer en vigtig katalytisk modulerende begivenhed, fordi det komplette kompleks er 300.000 gange mere effektivt end fri faktor Xa, der virker på protrombin i opløsning.24,72 En konsekvens af denne betydelige hastighedsforøgelse er, at enhver dissociation af komponenter fra komplekset reducerer enzymaktiviteten betydeligt og drastisk. Fraværet af membranoverfladen fra den komplette katalysator resulterer i et 1000-foldigt tab af katalytisk effektivitet, mens sletning af faktor Va fra komplekset resulterer i et 10.000-foldigt fald i hastigheden af thrombindannelse.24 Membranoverfladen er obligatorisk nødvendig, fordi den, selv om den kun bidrager lidt til den intrinsiske katalysehastighed, giver et miljø, hvor både faktor Va-faktor Xa-komplekset og substratet kan samkoncentrere sig.277 Prothrombin synes at koncentrere sig ved trombocytmembranoverfladen i stor udstrækning gennem de receptormedierede mekanismer, der er beskrevet tidligere. Faktor Va danner i kraft af sin membranbindingsevne et obligatorisk og højaffin interaktion med faktor Xa, fordi faktor Xa ikke vil binde sig til aktiverede trombocytter i fravær af faktor Va. Koncentration af reaktanter ved membranoverfladen resulterer i høje lokale koncentrationer af reagenser, som overstiger reaktionens iboende Km og forbedrer den katalytiske effektivitet betydeligt. Desuden øger faktor Va omsætningshastigheden af reaktionen ved en mekanisme, der endnu ikke er blevet rationaliseret.278
Kompleksdannelse giver også prothrombinasekomponenterne beskyttelse mod inhibitorer og/eller inaktivatorer. I modsætning til faktor Xa frit i opløsning er faktor Xa inkorporeret i prothrombinase (dvs. komplekseret med membranbunden faktor Va) beskyttet mod hæmning af antithrombin III og heparin.72 Ligeledes er faktor Va inkorporeret i prothrombinase beskyttet mod proteolytisk inaktivering af aktiveret protein C109,110 – en proces, der diskuteres i detaljer i det følgende afsnit.
Intrinsisk Xase moduleres af en række mekanismer svarende til dem, der er observeret med prothrombinase. Kompleksdannelse resulterer i en ca. 2 × 107-dobbelt forøgelse af den katalytiske effektivitet.217 Bindingen af faktor VIIIa og IXaβ til thrombin-aktiverede trombiner nedsætter Km for faktor X-aktivering 2500-foldigt og sætter faktor VIIIa i stand til at øge kcat ca. 7500-foldigt. Antithrombin III kan ikke hæmme faktor IXaβ i tilstedeværelse af faktor VIIIa og trombocytter.279 I lighed med faktor Va modulerer kompleksdannelse af faktor VIIIa med faktor IXaβ dens aktivitet. Dissocieringen af A2-underenheden fra heterotrimeren faktor VIIIa, som resulterer i et fuldstændigt tab af kofaktoraktivitet, forhindres af dens associering med faktor IXaβ på en membranoverflade,280 ligesom dens inaktivering med APC.62,281
Da faktor Va er absolut nødvendig for fysiologisk relevant trombinedannelse, kan betydelige variationer i protrombinaktivering opnås via proteolytiske, inaktiverende ændringer i kofaktoren, der katalyseres af aktiveret protein C. Proteolyse og inaktivering kræver, at faktor Va er trombocyt59,74 eller membranbundet.282 Tidlige undersøgelser viste, at inkubation af aktiveret protein C med trombinaktiverede trombinerede trombocytter gav et parallelt fald i faktor Xa-binding og protrombinaktivering, hvilket tyder på, at faktor Va efter spaltning af aktiveret protein C ikke binder faktor Xa.283,284 Derfor har aktiveret protein C-katalyseret inaktivering af faktor Va en dramatisk effekt på thrombindannelsen.
Humane trombocytter er i stand til at fremme og modulere den aktiveret protein C-katalyserede inaktivering af plasma- og trombocytafledt faktor Va, selv om disse to cofaktorpuljer ikke er ækvivalente substrater med hensyn til inaktivering. Tre spaltninger i den tunge kæde af det humane faktor Va-molekyl er nødvendige for en effektiv aktiveret protein C-katalyseret inaktivering: Spaltning ved Arg506 efterfulgt af spaltninger ved Arg306 og Arg679,282,285 Spaltningen ved Arg506 er hurtigere og går forud for den membranafhængige, inaktiverende spaltning ved Arg306,282 Den trombinaktiverede, humane trombocytoverflade spiller en vigtig rolle i den aktiverede protein C-katalyserede inaktivering af trombocytafledet faktor Va og faktor Va-varianten, faktor VaLeiden.109,110 Faktor VaLeiden er afledt af trombinaktivering af faktor VLeiden, en variant, hvor Arg506 er blevet erstattet af glutamin, hvorved det aktiverede protein C-spaltningssted ved position 506 stort set er fjernet.286 Således lider personer, der er homozygote (og i nogle tilfælde heterozygote) for denne mutation, af et dårligt antikoagulerende respons på aktiveret protein C og har en øget risiko for venøs trombose.287-289 De normale og muterede trombocytcofaktorer inaktiveres af aktiveret protein C med næsten identiske hastigheder; der opnås dog aldrig fuldstændig inaktivering af begge de trombocytafledte cofaktorer,109,110 fordi op til 50 % af den oprindelige aktivitet forbliver tilbage. Disse resultater står i klar kontrast til det, der er blevet observeret i undersøgelser af den aktiveret protein C-katalyserede inaktivering af plasmaafledt faktor Va og faktor VaLeiden på syntetiske fosfolipidvesikler.290-292 I disse undersøgelser observeres altid fuldstændig inaktivering af kofaktorerne, selv om plasmafaktor VaLeiden inaktiveres med en væsentlig langsommere hastighed end normal plasmafaktor Va. I blodpladeundersøgelser forbliver der større restaktivitet af både trombocytafledet faktor Va og faktor VaLeiden, når der anvendes trombinaktiverede blodplader som inaktiverende membranoverflade, i modsætning til den næsten fuldstændige inaktivering, når syntetiske fosfolipidvesikler anvendes som inaktiverende overflade.110 Aktiverede blodplader beskytter således de trombocytafledte kofaktorer mod aktiveret protein C-katalyseret inaktivering.109,110
Aktiverede trombocytter beskytter også den normale plasmaafledte faktor Va mod inaktivering ved aktiveret protein C ved at bremse spaltningen ved Arg506.110 I modsætning til den trombocytafledte cofaktor kan plasmaafledt faktor Va imidlertid inaktiveres fuldstændigt af aktiveret protein C, hvilket tyder på, at de to forskellige cofaktorpuljer (plasma vs. trombocytter) er forskellige substrater for APC.110 Disse undersøgelser bekræfter igen betydningen af bindingsbegivenheder ved modulering af protrombinaseaktivitet. De viser også, at trombocytmembraner og syntetiske fosfolipidmembraner ikke er ækvivalente overflader i reguleringen af enzymkompleksdannelsen. Samlet set tyder disse undersøgelser på, at trombocytter opretholder prokoagulerende hændelser ved at tilvejebringe en membranoverflade, der forsinker kofaktorinaktivering, og ved at frigive et kofaktormolekyle, der udviser en aktiveret protein C-resistent fænotype.
Det er interessant at overveje, at på steder med arteriel skade kan faktor VLeiden-mutationen måske ikke så let forudsige arteriel trombose, fordi de normale og variant af trombocytafledte kofaktorer er lige resistente over for aktiveret protein C på den aktiverede trombocytoverflade. Faktisk kan den påviste rolle, som faktor VLeiden-mutationen spiller ved forudsigelse af venøs trombose287-289 , afspejle den dokumenterede resistens af den plasmaafledte faktor VaLeiden-kofaktor sammenlignet med normal, plasmaafledt faktor Va.290-292 Plasma-kofaktorpuljen kan spille en mere betydningsfuld rolle ved venøs trombose på grund af manglen på et betydeligt bidrag fra blodpladerne. På stedet for en arteriel trombus kan den trombocytafledte kofaktor, som følge af dens frigivelse og aktivering, derimod være til stede i en koncentration, der er over 600 gange højere end plasmakofaktoren.106