Materialer:
30 ml eksponentiel kultur af SF9-celler ved 5×105 celler/ml
6 brøndeplader (2 stk.)
1 flaske 4% agarosegel
1 flaske SF-900 (1.3X) medium
1steril flaske
0,5 ml baculovirus supernatant
100 ml SFM
1. Under sterile forhold fordeles 2 ml cellesuspension pr. brønd.
2. Lad cellerne sætte sig i bunden af pladen og inkuberes tildækket ved RT i 1 time.
3. Flasken med agarosegel anbringes i et vandbad på 70oC. Den tomme flaske og SF-900 (1,3X) anbringes i 40oC-badet.
4. Efter 1 times inkubation af pladerne ved RT observeres monolagene under inverteretmikroskop for at bekræfte celletilhæftning og 50% konfluens.
5. Fremstil otte-log seriel fortynding af den høstede virale supernatant ved sekventielt at fortynde 0,5 ml af den foregående fortynding i 4,5 ml SFM-medium i 12-mld. Man bør slutte med 8 rør, der hver indeholder en 10-1til 10-8 fortynding af den oprindelige virusbestand.
7. Fjern sekventielt supernatanten fra hver brønd, kassér den og erstat den straks med 1 ml af den respektive virusfortynding til hver duplikatbrønd. Inkubér i 1 time vedRT.
8. Flyt flaskerne fra vandbadet til den sterile hætte, når agarosen er flydende (20-30 min.). 30 ml SF-900 (1,3X)-medium og 10 ml 4 % agarosegel overføres hurtigt til den tomme flaske, og der blandes forsigtigt. Sæt flasken med plaquing-overlays tilbage i vandbadet på 40oC indtil brug.
9. Efter denne anden inkubation på 1 time returneres flasken med fortyndet agarose og de 6 brøndeplader til emhætten.
10.Efterfølgende (fra høj til lav fortynding) fjernes virus fra brøndene og erstattes med 2 ml af den fortyndede agarose. Arbejd hurtigt for at undgå udtørring af monolaget.En Pasteurpipette tilsluttet en vakuumpumpe fjerner let spor af inokulum.
11.Ladgel hærde i 10 til 20 minutter, før det flyttes.
12.Inkubér ved 27oC i en fugtig inkubator i 4 til 10 dage.
13.Rekombinantvirus producerer mælkeagtige/grå plakater med svag kontrast, der er synlige uden farvning eller andre detektionsmetoder.
14.Overvågningspladerne overvåges dagligt, indtil antallet af plakater ikke ændres i to på hinanden følgende dage.
15.For at bestemme titerne af det anvendte inokulum er det optimale interval for tælling 3 til 20 plakater pr. brønd i en 6-brøndeplade. Titer (pfu/ml) kan beregnes ved følgende formel:
16. Overlejring af agarose med naturligt rødt farvestof:
Overlay 0,5 % agaroseløsning i SFM
tilsæt Natural Red-opløsning til en slutkoncentration på 50 mg/ml (fortyndet 3,33 mg/ml stamme 1:66,6).
Overlay 1 ml af farveløsningen til hver brønd (på en 6 brønde plade).
Overlay 1 ml af farveløsningen til hver brønd (på en 6 brønde plade).